SaRNA介導的TRPV5激活對大鼠草酸鈣結石形成的作用研究.pdf

1、腎結石為全球性常見疾病之一，可引起持續(xù)性疼痛、血尿、發(fā)熱等癥狀，嚴重者可導致腎功能不全，患病率呈逐年增加的趨勢，且復發(fā)率高。草酸鈣為最常見的結石類型，占80％以上。鈣是腎結石最常見的陽離子，高鈣尿是腎結石形成最主要的危險因素之一。鈣離子通道蛋白TRPV5主要表達于腎遠曲小管及集合管，被認為是腎臟對鈣的轉運及重吸收的門控蛋白。TRPV5基因敲除小鼠可出現(xiàn)有意義的鈣漏，從而導致嚴重的高鈣尿，表明TRPV5是與高鈣尿相關的重要基因。RNA激活

2、（RNAa）是由靶向基因啟動子的小雙鏈RNA（dsRNA）介導的基因表達激活，這種小雙鏈RNA被稱為小激活RNA（SaRNA）。在本研究中，我們擬檢驗SaRNA介導的TRPV5激活對大鼠草酸鈣結石形成的作用。
　　目的:
　　本研究擬篩選出可激活大鼠鈣離子通道蛋白TRPV5表達的小激活RNA（SaRNA），構建其重組慢病毒載體并建立穩(wěn)定激活TRPV5表達的大鼠腎小管上皮細胞株（NRK-52E細胞株），同時研究一水草酸鈣晶體（

3、COM）對TRPV5表達的影響，最后進行動物實驗檢驗SaRNA介導的TRPV5激活對大鼠草酸鈣結石形成的作用。
　　方法:
　　1.我們設計并合成了5個靶向大鼠TRPV5基因啟動子的SaRNA，利用脂質體轉染的方法將其轉染進NRK-52細胞，通過Western blot篩選可激活TRPV5表達的SaRNA。
　　2.篩選出的小激活RNA及陰性對照序列插入慢病毒表達載體LV3中，然后構建重組慢病毒載體；利用產(chǎn)生的慢病毒感

4、染NRK-52E細胞，然后通過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定細胞株，穩(wěn)定細胞株分別命名為 NRK-control及NRK-TRPV5-SaRNA。
　　3.以不同濃度的一水草酸鈣晶體（COM）處理NRK-52E細胞，通過Western blot檢測其對TRPV5表達的影響。
　　4.通過輸尿管逆行注射的方式進行大鼠慢病毒的感染，通過1%的乙二醇（EG）誘導大鼠草酸鈣結石的形成，最后通過大鼠24h尿檢測、血樣本檢測以及晶體計數(shù)等方法檢驗

5、SaRNA介導的TRPV5激活對大鼠草酸鈣結石形成的作用。
　　結果:
　　1. Western blot結果顯示：與對照組相比，ds-320（合成的5個SaRNA的其中一個）可明顯激活TRPV5的表達，而其他序列對TRPV5的表達無影響。
　　2.與NRK-control穩(wěn)定細胞株相比，NRK-TRPV5-SaRNA穩(wěn)定細胞株的TRPV5 mRNA及蛋白的表達明顯升高。
　　3. COM處理可使NRK-52E細

6、胞TRPV5的表達升高，且COM濃度越高時TRPV5表達的升高越明顯；此外，ds-320與COM共處理NRK-52E細胞時，TRPV5蛋白的表達高于ds-320或COM單獨處理。
　　4.動物實驗結果顯示，與control組相比，EG+ds-NC組的尿鈣濃度升高，然而與EG+ds-NC組相比，EG+ds-320組的尿鈣濃度下降；與預期結果一致，control組無晶體形成， EG+ds-NC組有大量晶體形成，然而與 EG+ds-NC