耐熱堿性磷酸酶耐熱機(jī)理研究和互補(bǔ)密碼子使用關(guān)系探討.pdf

1、該文利用法國(guó)的NPS@服務(wù)器預(yù)測(cè)TAP的二級(jí)結(jié)構(gòu),并依據(jù)保持末端二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的前提選擇了合適的切除位點(diǎn)去除TAP兩端的非功能結(jié)構(gòu)域,經(jīng)過(guò)克隆、表達(dá)得到了有活性的TAP<'N34C25>(TAP的N端去掉34個(gè)氨基酸而C端去掉25個(gè)氨基酸).其最適反應(yīng)溫度和活化能比TAPND27有所上升;而最高耐受溫度和Km值有所下降.TAP的功能結(jié)構(gòu)域由此被進(jìn)一步定位在35~476氨基酸之間.該實(shí)驗(yàn)不僅更為精確地定位了TAP的功能結(jié)構(gòu)域,而且提供了以

2、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果指導(dǎo)切割位點(diǎn)選擇的范例,為功能結(jié)構(gòu)域的定位提供了一種新的有效方法.利用突變的方法研究突變位點(diǎn)對(duì)TAP耐熱性的影響,構(gòu)建了兩個(gè)單位點(diǎn)突變體(A410→T和P396→S)和兩個(gè)多位點(diǎn)突變體(N100→S、T320→I和N100→S、P396→S、A410→V、P490→S),進(jìn)行全序列及表達(dá)產(chǎn)物的最高耐受溫度和最適反應(yīng)溫度測(cè)定和酶分子高級(jí)結(jié)構(gòu)的模擬,分析突變位點(diǎn)、高級(jí)結(jié)構(gòu)和耐熱性表現(xiàn)三者的關(guān)系,探討引起耐熱性變化的機(jī)理.二價(jià)

3、金屬離子對(duì)TAP耐熱性的影響也作了一些探討,在Mn<'2+>,Zn<'2+>,Mg<'2+>和Ca<'2+>四種離子存在的條件下分別檢測(cè)了耐熱堿性磷酸酶TAP和它的兩個(gè)多位點(diǎn)突變體耐熱性和最適反應(yīng)溫度的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mn<'2+>,Zn<'2+>,Mg<'2+>使得這兩個(gè)突變體的耐熱性有所升高,而Ca<'2+>卻降低了它們的耐熱性.另外,對(duì)于互補(bǔ)密碼子對(duì)的使用關(guān)系也進(jìn)行了一些統(tǒng)計(jì)分析.使用基于.NET平臺(tái)的C＃語(yǔ)言編制了密碼子使用頻率統(tǒng)