新型犬流感病毒H5N2亞型病原學(xué)調(diào)查及其HA,NP,NA基因序列分析.pdf

1、2009年本實驗室展光建等人從犬中分離到一株新型H5N2亞型流感病毒，隨后宋倩倩等人又通過致病性實驗證明該亞型的病毒在犬間進(jìn)行水平傳播，這也進(jìn)一步警示人們該亞型流感病毒可能會成為潛在的流行毒株。為揭示該亞型病毒在自然犬的流行情況以及其在自然狀態(tài)下的變異情況，本研究對該亞型流感病毒進(jìn)行了病原學(xué)調(diào)查，并采用分子生物學(xué)技術(shù)對其HA、NA、NP基因進(jìn)行了序列分析。
　　 本研究共采集了96份疑似流感病毒感染的病犬的鼻拭子樣品，對樣品進(jìn)行

2、常規(guī)處理，接種9-11日齡的雞胚，進(jìn)行病毒分離鑒定，成功分離到三株病毒，經(jīng)血凝試驗/血凝抑制試驗、RT-PCR以及基因序列分析，這三株病毒均為H5N2亞型流感病毒，分別將這3株H5N2亞型流感病毒命名為A/Canine/Shan Dong/01/2012(H5N2)、A/Canine/Shan Dong/02/2012(H5N2)、A/Canine/Shan Dong/03/2012(H5N2)，以上病毒簡稱為CA/SD/01/12(H

3、5N2)、CA/SD/02/12(H5N2)、CA/SD/03/12(H5N2)。
　　 三株病毒的HA蛋白上有許多受體結(jié)合位點，這些結(jié)合位點上的氨基酸序列均很保守，在HA蛋白受體結(jié)合位點方面分離株CA/SD/01/12(H5N2)、CA/SD/02/12(H5N2)、CA/SD/03/12(H5N2)與其他參考株相似，均沒有發(fā)生較大的突變。在核苷酸同源性方面，CA/SD/01/12(H5N2)，CA/SD/02/12(H5N2

4、)，CA/SD/03/12(H5N2)彼此都達(dá)到90.0％以上。三株分離株均與A/Dog/Shandong/JT01/2009同源性最高，分別可達(dá)到99.4％、99.3％、99.6％。在蛋白位點方面三株分離株與參考株A/Dog/Shandong/JT01/2009相比均只發(fā)生一處突變，三株病毒蛋白裂解位點均為PQ↓ REIRRK，從分子水平推論均屬于非高致病性毒株。CA/SD/01/12(H5N2)所測HA蛋白有3個糖基化位點，分別為-

5、NQTD-，-NSSM-，-NGTY-，分別在169、310、478位;CA/SD/02/12(H5N2)所測HA蛋白有4個糖基化位點-NQTD-，-NSSM-，-NGTY-，-NSSY-分別位于169、310、460、478位;CA/SD/03/12(H5N2)所測HA蛋白有3個糖基化位點-NQTD-，-NSSM-，-NSSY-分別位于169、310、460位;糖鏈的改變對毒株的毒力也有十分重要的影響，糖基化位點處發(fā)生改變很容易導(dǎo)致H

6、A對蛋白酶的敏感性增強，可以使毒株變?yōu)楦咧虏⌒浴?br>　　 三株病毒的NA基因全長1309bp，可編碼401個氨基酸，該基因在核苷酸同源性方面，CA/SD/01/12(H5N2)，CA/SD/02/12(H5N2)，CA/SD/03/12(H5N2)都達(dá)到90.0％以上，且該三株分離株均與A/Dog/Shandong/JT01/2009核苷酸同源性較高分別可達(dá)到98.1％、98.3％、98.4％，從而證明我們所分離到的三株H5N2病

7、毒的NA基因與參考株A/Dog/Shandong/JT01/2009具有最近的親緣關(guān)系。在NA基因的頸部有幾個重要的氨基酸殘基分別位于118位、119位、151位、152位;同時在NA基因的頭部有7個重要的抗體表位，在分離株中這些重要的氨基酸殘基以及抗體位點均未發(fā)現(xiàn)變異。但是在該基因的其他部位與參考毒株A/Dog/Shandong/JT01/2009相比CA/SD/01/12(H5N2) CA/SD/01/12(H5N2) CA/SD/

8、01/12(H5N2)發(fā)現(xiàn)了多處突變。三株分離株彼此之間也存在突變，CA/SD/01/12(H5N2)與CA/SD/02/12(H5N2)位于第36位、CA/SD/01/12(H5N2)與CA/SD/03/12(H5N2)位于第233位、CA/SD/02/12(H5N2)與CA/SD/03/12(H5N2)突變位于第36位和第233位。據(jù)此我們推測病毒的復(fù)制能力可能會受到一些影響同時也可能影響到分離株病毒的宿主范圍。
　　 NP

9、基因經(jīng)PCR擴增后全長1592bp，編碼508個氨基酸，核苷酸同源性方面，CA/SD/01/12(H5N2)，CA/SD/02/12(H5N2)，CA/SD/03/12(H5N2)都達(dá)到90.0％以上。三株分離株在核苷酸同源性方面與A/Dog/Shandong/JT01/2009以及A/Swine/Fujian/F1/2001(H5N1)均很高且均可達(dá)到99.5％以上，但該蛋白在氨基酸同源性方面卻與A/Swine/Fujian/F1/2

10、001(H5N1)較為接近，其同源性分別可達(dá)到99.1％、99.5％、99.3％。在蛋白位點方面三株分離株與參考株A/Dog/Shandong/JT01/2009相比CA/SD/01/12(H5N2) CA/SD/01/12(H5N2) CA/SD/01/12(H5N2)發(fā)現(xiàn)了多處突變。;CA/SD/01/12(H5N2)與CA/SD/02/12(H5N2)相比存在1處突變位于第102位，CA/SD/01/12(H5N2)與CA/SD/

11、03/12(H5N2)相比存在2處突變分別位于第153位和第154位，CA/SD/02/12(H5N2)與CA/SD/03/12(H5N2)相比存在3處突變，分別位于第102位、153位和154位。
　　 該實驗是繼2009年第一次分離到該亞型流感病毒之后，又成功分離到三株犬H5N2新型流感病毒，進(jìn)一步證明了新型H5N2亞型犬流感病毒在犬中存在、流行。因犬與畜禽的關(guān)系密切，尤其犬作為寵物，飼養(yǎng)量越來越大，這畜禽的健康養(yǎng)殖以及人類