NA蛋白影響H3N2亞型犬流感病毒復(fù)制的分子機(jī)制.pdf

1、2007年以來(lái)，亞洲新發(fā)H3N2亞型犬流感病毒(Canine influenza virus，CIV)在我國(guó)廣泛流行，引起犬急性傳染病—犬流感。研究發(fā)現(xiàn)，H3N2CIV來(lái)源于禽源H3N2亞型流感病毒，經(jīng)變異演化后感染的犬。早期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H3N2CIV可通過空氣在犬間傳播，也可繼續(xù)感染其它哺乳動(dòng)物，包括鼠和豚鼠，但喪失對(duì)禽的感染力。禽源的H3N2CIV對(duì)犬的致病機(jī)制到底如何，目前尚不清楚。HA和NA基因在流感病毒的致病方面起著重要作

2、用。鑒于此，本研究用禽源病毒的HA或NA單基因替換掉H3N2CIV的相應(yīng)基因，并拯救獲得了以H3N2CIV為背景的重組病毒。將這些重組病毒感染BALB/c小鼠，確定了H3N2CIV復(fù)制的關(guān)鍵基因及其氨基酸位點(diǎn)，并深入探討影響其復(fù)制的致病機(jī)制，具體內(nèi)容如下:
　　1.確定H3N2CIV復(fù)制的關(guān)鍵基因
　　本研究早期篩選到了兩株高度同源的病毒，一株引起犬發(fā)病的犬流感病毒A/canine/influenza virus/01/20

3、10(H3N2)(簡(jiǎn)稱為C1)和一株不感染犬發(fā)病的禽流感病毒A/duck/shanghai/06/2009(H3N2)(簡(jiǎn)稱為)D6，并建立這兩株病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)。拯救得到與原毒株基因序列一致的重組病毒，分別命名為rC1和rD6。用D6毒株的HA或NA單基因替換C1對(duì)應(yīng)基因，并拯救得到以C1為背景的兩株重組病毒，分別命名為C1-D6HA和C1-D6NA。通過滴鼻途徑感染5周齡BALB/c小鼠，106EID50/只。結(jié)果表明，親本毒

4、rC1在鼠的肺臟中復(fù)制良好，而C1-D6NA基本上無(wú)法復(fù)制。同時(shí)，通過病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，感染了rC1毒株的小鼠肺臟有明顯的病理變化，而感染C1-D6NA毒株的小鼠肺臟基本無(wú)病理變化。根據(jù)這些結(jié)果，我們認(rèn)為CIV的NA基因可能是該病毒致病的關(guān)鍵基因。
　　2.確定H3N2CIV復(fù)制的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)
　　利用Lasergene7.0軟件分析和比較了大量H3N2亞型犬流感病毒和同亞型的禽流感病毒的NA序列，最后在CIV的NA蛋白

5、序列上鎖定了4個(gè)可疑的氨基酸位點(diǎn)，構(gòu)建相應(yīng)的pBD突變質(zhì)粒，并拯救獲得了4株點(diǎn)突變重組病毒，分別命名為C1-NA(L24M)、C1-NA(K54E)、C1-NA(S154P)和C1-NA(G430R)。小鼠致病性實(shí)驗(yàn)表明，親本毒rC1和C1-NA(L24M)、C1-NA(G430R)病毒在鼠的肺臟上皆能良好復(fù)制，但C1-NA(K54E)和C1-NA(S154P)重組病毒無(wú)法在鼠肺臟中復(fù)制。進(jìn)一步地犬腎細(xì)胞(Madin-Darby can

6、ine kidney，MDCK)增殖試驗(yàn)結(jié)果與鼠的致病性結(jié)果相似。因此，我們認(rèn)為C1-NA的54K和154S可能是H3N2CIV致病的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。
　　3.H3N2CIV復(fù)制的分子機(jī)制
　　酶活性是流感病毒NA蛋白重要的功能之一。那么，CIV-NA的54K和154S是否通過調(diào)控NA蛋白的酶活性，從而影響H3N2CIV的致病性呢？為此，利用無(wú)特異性病原(Specific pathogen free，SPF)雞胚擴(kuò)增rC1及

7、其NA點(diǎn)突變重組病毒C1-NA(L24M)、C1-NA(K54E)、C1-NA(S154P)和C1-NA(G430R)，檢測(cè)NA酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組病毒C1-NA(K54E)和C1-NA(S154P)的NA酶活性明顯低于rC1及其他2株重組病毒C1-NA(L24M)和C1-NA(G430R)，即54K和154S可顯著增強(qiáng)H3N2CW的NA酶活性。這種NA酶活性的改變，是否會(huì)影響病毒的釋放呢？為此，我們進(jìn)行了紅細(xì)胞病毒釋放試驗(yàn)和子代病毒在