基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的賴草根莖發(fā)育調(diào)控基因分析及應(yīng)用研究.pdf

1、賴草是多年生禾本科根莖（根狀莖）型植物，是異形四倍體物種(2n=4x=28)。分蘗是單子葉植物一種獨(dú)特的分枝現(xiàn)象，在發(fā)育生物學(xué)上具有特殊的意義。通過根莖逐級(jí)分蘗即克隆生長(zhǎng)進(jìn)行無性繁殖的根莖類禾草是草原牧草種群及群落結(jié)構(gòu)的重要組成部分。很多優(yōu)良牧草都具有地下根莖，通過不斷分蘗進(jìn)而形成縱橫交錯(cuò)的地下根莖網(wǎng)及與之對(duì)應(yīng)的地上子代分株。賴草根莖頂芽可呈現(xiàn)水平和垂直兩種生長(zhǎng)方向性，本研究主要運(yùn)用RNA-seq技術(shù)探討了根莖頂芽不同生長(zhǎng)狀態(tài)下發(fā)育調(diào)控

2、關(guān)聯(lián)基因及可能的調(diào)控通路。結(jié)合形態(tài)解剖學(xué)分析和關(guān)鍵基因驗(yàn)證檢測(cè)分析，試圖初步揭示賴草根莖頂芽發(fā)育基因調(diào)控機(jī)理及內(nèi)在分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)賴草水平根莖頂芽和垂直根莖頂芽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序總共測(cè)得了49.01Gb的數(shù)據(jù)，每個(gè)樣品Clean Data值都在7.84Gb以上，Q30堿基百分比均≥94.76％。組裝后共獲得了76098條Unigene。在各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共注釋到44769條Unigene。對(duì)Unigene庫(kù)的基因結(jié)構(gòu)分析

3、，發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記5397個(gè)。KEGG注釋結(jié)果提示垂直生長(zhǎng)根莖頂芽在生長(zhǎng)方向由水平延伸轉(zhuǎn)為逆地生長(zhǎng)后（垂直），盡管還未伸出地面，但光合相關(guān)功能基因已經(jīng)提早啟動(dòng)表達(dá)。
　　(2)結(jié)果表明賴草水平根莖尖和垂直根莖尖在基因表達(dá)水平上總共有4906個(gè)差異基因，其中1970個(gè)基因在水平根莖中是上調(diào)，2936個(gè)基因在垂直根莖中是上調(diào)。經(jīng)過KEGG注釋發(fā)現(xiàn)這些差異基因在以下幾個(gè)通路中差異表達(dá)顯著:光合作用;光合作用天線蛋白;亮氨酸代謝;谷胱甘肽代

4、謝;生物素代謝;谷胱甘肽生物合成過程。在賴草水平根莖和垂直根莖4906個(gè)差異基因里，通過基因注釋，發(fā)現(xiàn)其中含有32個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，132個(gè)激酶。其中，有很多轉(zhuǎn)錄因子和激酶都與根莖的生長(zhǎng)發(fā)育和植物抗逆性相關(guān)，這一預(yù)測(cè)結(jié)果提示:賴草水平根莖頂芽在株系擴(kuò)展、延伸生長(zhǎng)過程中，可能首先感知到生物或非生物脅，并啟動(dòng)相應(yīng)應(yīng)激代謝過程;同時(shí)，這一結(jié)果也反映出水平延伸根莖頂芽與逆地生長(zhǎng)的垂直根莖頂芽相比，應(yīng)激反饋更復(fù)雜。
　　(3)為驗(yàn)證RNA-seq

5、的結(jié)果，我們利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè)，我們隨機(jī)挑選了12個(gè)差異基因進(jìn)行qRT-PCR分析，測(cè)得的結(jié)果跟RNA-Seq測(cè)序結(jié)果高度一致，說明測(cè)序所得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性很高，信息學(xué)分析的結(jié)果可信。
　　(4)通過對(duì)賴草根莖尖進(jìn)行樹脂切片發(fā)現(xiàn):賴草水平根莖跟垂直根莖橫切片相比，水平根莖表皮層細(xì)胞較大，細(xì)胞壁較厚，組成薄壁組織環(huán)的薄壁細(xì)胞層數(shù)較多，維管束環(huán)數(shù)較多。這可能跟它們即將行使的生理功能有關(guān)，水平根莖在沙土中生長(zhǎng)，需要穿過