紫花苜?？购D錄組測序分析及MsNCX和MsCML基因的功能研究.pdf

1、紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是多年生豆科牧草，北方寒冷的天氣嚴重影響紫花苜蓿的產量。紫花苜蓿在寒冷冬季的存活率取決于根頸芽的數(shù)量和返青能力。為了研究紫花苜?？购缘姆肿訖C制，本研究利用高通量測序技術對紫花苜蓿根頸芽進行轉錄組測序分析，獲得大量與抗寒相關的轉錄本。克隆鈣信號相關的MsNCX和MsCML抗寒基因，并分析這兩個基因在植物抵御非生物脅迫方面的功能。本研究主要結果如下:
　　1.轉錄組測序分析紫花苜?？购?/p>

2、機制
　　利用Illumina平臺對紫花苜蓿根頸芽進行轉錄組測序，獲得與抗寒相關基因在轉錄水平的動態(tài)變化。獲得響應冷凍脅迫的差異表達基因共5605個，其中1900個上調差異表達，3705個下調差異表達。GO注釋分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要聚類在生物學過程的有機環(huán)狀化合物代謝過程，氧化還原過程和單一生物代謝過程;細胞成分的細胞壁，膜蛋白等;分子功能的核酸結合，結合和催化活性等子集中。差異表達基因主要是轉錄因子和各種信號傳導元件的關鍵基

3、因。350個差異表達基因被注釋為轉錄因子功能，屬于AP2/EREBP、Hsfs、MYB、bHLH、WRKY、NAC、bZIP和MADS等轉錄因子家族。鈣信號傳導途徑（如陽離子轉運基因和類鈣調素基因），植物激素信號傳導途徑和蛋白泛素化途徑關鍵基因被富集，呈現(xiàn)出上調表達。參與代謝途徑的基因也被富集，呈現(xiàn)下調表達。
　　差異表達基因表達模式分析結果表明，編碼功能蛋白和調節(jié)蛋白的差異表達基因在紫花苜蓿冷適應和冷凍脅迫時期均上調表達，編碼調

4、節(jié)蛋白的差異表達基因在休眠期基因表達量高于冷凍脅迫時期。與冷凍脅迫時期相比，不是所有的基因在返青時期會被誘導。qRT-PCR結果與轉錄組測序結果相關性很高，驗證了轉錄組測序數(shù)據(jù)的準確性。
　　通過qRT-PCR分析紫花苜蓿在連續(xù)兩年越冬期的基因表達模式，結果顯示，鈣信號和和抗氧化酶基因在紫花苜蓿連續(xù)兩年的越冬期基因表達模式相同，激素信號傳導途徑相關的基因在冷適應和冷凍脅迫時期表達趨勢一致，返青期基因表達變化不同，說明鈣信號相關基因

5、在紫花苜?？购^程中起到重要作用。
　　2.紫花苜蓿MsNCX基因克隆和功能研究
　　克隆獲得紫花苜蓿MsNCX基因，該基因具有一對Na+/Ca2+結構域，編碼597個氨基酸的多肽，紫花苜蓿MsNCX蛋白與蒺藜苜蓿MtCAX蛋白同源。MsNCX基因在紫花苜蓿根，莖，葉中均有表達，在根中表達量最高;低溫脅迫下，MsNCX基因在紫花苜蓿葉片中快速響應;根中MsNCX基因響應鹽脅迫最劇烈;在干旱和鹽堿脅迫下，根中MsNCX基因在脅

6、迫6h表達量達到最高;根中MsNCX基因在ABA脅迫12h表達量達到最高。
　　構建pCBM-MsNCX植物表達載體，并對煙草進行遺傳轉化研究。通過草丁膦篩選，PCR和qRT-PCR檢測，選取表達量較高的4個株系用于后續(xù)功能分析。過表達MsNCX煙草的抗寒性顯著提高，表現(xiàn)為存活率較高，冷脅迫后MDA較低，抗氧化酶活性提高，積累較多的脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖。與野生型相比，在鹽和干旱脅迫下，轉基因株系葉綠素含量降低較慢，超氧陰離

7、子和過氧化氫含量較低;CAT酶活性顯著提高，同時積累較多的滲透保護性物質，尤其是脯氨酸。鹽脅迫下，轉基因株系葉片中積累較低的Na+含量，較高的K+含量。轉基因株系中脅迫響應基因表達量顯著高于野生型，說明MsNCX基因可提高煙草抵御非生物脅迫的能力。
　　3.紫花苜蓿MsCML基因克隆和功能研究
　　克隆獲得紫花苜蓿MsCML基因，含有一個EF-hand結構域，編碼196個氨基酸的多肽，紫花苜蓿MsCML蛋白與鷹嘴豆CaCML

8、45蛋白親緣關系最近。MsCML基因在紫花苜蓿在莖中表達量最高，其次是根，表達量最少的是葉片。紫花苜蓿葉片中MsCML基因快速響應不同的非生物脅迫，結果如下，在冷和鹽脅迫1h后MsCML基因表達量劇烈升高;在鹽堿和ABA脅迫下，MsCML基因在脅迫3h表達量達到最大值;在甘露醇脅迫下，MsCML基因在脅迫24h表達量達到最大值，說明紫花苜蓿MsCML基因對非生物脅迫的早期應答過程起到重要作用。
　　構建過表達植物表達載體pCBM-

9、MsCML，并對煙草進行遺傳轉化研究。通過草丁膦篩選，PCR和qRT-PCR檢測，選取表達量較高的3個株系用于后續(xù)功能分析。過表達MsCML煙草的抗寒性顯著提高，可以快速恢復冷脅迫造成的損傷，與野生型相比，經(jīng)冷脅迫后葉片電導率和MDA較低，抗氧化酶活性提高，積累較多的脯氨酸和可溶性蛋白質。在鹽和干旱脅迫下，轉基因株系比野生型具有更高的葉綠素含量，超氧陰離子和過氧化氫含量較低;抗氧化酶系活性提高，同時積累較多的脯氨酸減少非生物脅迫帶來的損