基于RNA測序技術的馬氏珠母貝珍珠囊轉錄組及數(shù)字基因表達譜分析.pdf

1、本文以我國海水珍珠的主要生產(chǎn)貝類——馬氏珠母貝(Pinctada martensii)的珍珠囊為研究對象,構建了1個轉錄組文庫和6個不同發(fā)育時期的數(shù)字基因表達譜(Digital gene expression,DGE)文庫,運用新興的RNA高通量測序(RNA-seq)技術對構建的文庫開展測序、組裝和生物信息學分析。同時,利用熒光實時定量PCR技術(Real—time PCR,qRT-PCR)擴增免疫和礦化相關基因在6個不同發(fā)育階段的表達

2、變化規(guī)律,以達到驗證測序分析的目的。
　　 對轉錄組文庫測序,得到39,400,004條原始reads,總核苷酸數(shù)為3,546,000,360nt。其中,GC含量、Q20和未知堿基的百分比分別為42.94％、94.65％和0.01％。對原始reads進行拼接組裝,得到102,762條Unigene,其中有46,387個功能完整的各種長度編碼區(qū)域被識別,且這些Unigene編碼的蛋白大多數(shù)都超過了200個氨基酸。這些轉錄本中,大約

3、有23,081條Unigene可能參與了219個已知的代謝或信號通路。與Nr數(shù)據(jù)庫、Swissprot數(shù)據(jù)庫、GO分類和COG數(shù)據(jù)庫比對,分別有36,989、30,592、7,700和10,414個轉錄本被注釋或分類,COG分類揭示有447個轉錄本的功能目前尚未被報道。已注釋的轉錄本中有453條Unigene與無脊椎動物免疫基因相關,103條與生物礦化基因相關。
　　 對珍珠囊發(fā)育第5、10、15、20、30和60天的DGE文庫

4、測序,得到的原始Tag均為5,000,000,去除雜質標簽后得到Clean Tag分布在250萬到.340萬之間,平均占總Tag數(shù)的94.91％；六個DGE數(shù)據(jù)庫能夠比對到轉錄組數(shù)據(jù)庫中的Clean Tag占總Clean Tag的26.32％,即在珍珠囊發(fā)育的6個時期中,一些高表達的基因在轉錄組文庫中沒有出現(xiàn)。珍珠囊發(fā)育的第5、10、15、20和30天的表達譜與第60天的相比,分別有2192、1902、2108、1475和1368個差異

5、表達基因,尤其是在第15天差異表達基因數(shù)目有明顯增加的趨勢。與轉錄組文庫比較分析發(fā)現(xiàn),在153條與免疫相關的Unigene中,30條在珍珠囊不同發(fā)育時期有顯著差異表達(P<0.05),它們分別編碼溶菌酶、Toll樣受體、堿性磷酸酶、清道夫受體、酸性磷酸酶和凝集素等蛋白；在103條與生物礦化相關的Unigene中,13條在珍珠囊發(fā)育不同時期有顯著差異表達(P<0.05),它們分別編碼皮連蛋白、酪氨酸類似蛋白、perlwapin、鈣調素蛋白

6、家族等蛋白。
　　 從有顯著差異表達的Unigene中選擇與免疫和礦化相關的基因各一個,進行熒光定量PCR驗證實驗。結果表明,溶菌酶基因在珍珠囊發(fā)育前30天的表達水平處于較低的水平,在第30天表達顯著上調,然后開始下調,第60天時表達水平基本恢復到原來狀態(tài)。皮連蛋白基因在珍珠囊發(fā)育的前20天沒有明顯的差異表達,第30天時該基因發(fā)生顯著上調,直到第60天該基因的表達基本保持了較高的水平。熒光定量對這兩個基因表達的分析結果與DGE檢