大腸埃希菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因型鑒定及藥敏預(yù)測.pdf

1、目的:超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrumβ-Lactamases,ESBLs)是絲氨酸蛋白酶的衍生物,它能夠水解青霉素、廣譜及超廣譜頭孢菌素和單環(huán)β-內(nèi)酰胺抗生素的β-內(nèi)酰胺酶,導(dǎo)致對多種抗生素的耐藥性,感染者病死率極高,而且產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌很容易傳遞擴(kuò)散,導(dǎo)致對抗生素耐藥細(xì)菌的廣泛傳播,危害極大。因此快速檢測產(chǎn)ESBLs細(xì)菌及其型別,及早預(yù)測出其藥敏結(jié)果并指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。本研究以產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺

2、酶ESBLs大腸埃希菌為目標(biāo),采用毛細(xì)管電泳法(CE),對相應(yīng)臨床分離株耐藥酶基因型別進(jìn)行鑒定。結(jié)果證實(shí)該法與傳統(tǒng)平板凝膠電泳相比,具有分離速度快,分辨率高等優(yōu)勢,可以借此技術(shù)快速鑒定產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌ESBLs基因型別。耐藥菌分離出的主要目的通過藥敏試驗指導(dǎo)臨床抗感染治療?，F(xiàn)行的美國臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的藥敏試驗提供抗生素的敏感性結(jié)果,需要進(jìn)行至少18小時以上的培養(yǎng)過程,不利于抗感染治療的早期診斷。由于氣相色譜(G

3、C)具有很強(qiáng)的多組分分離能力,質(zhì)譜(MS)具有較強(qiáng)的定性特點(diǎn),氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有兩者結(jié)合優(yōu)勢是比較顯著的,可以檢測代謝產(chǎn)物中的復(fù)雜組分。因此本研究擬運(yùn)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS),定性定量分析細(xì)菌在低劑量頭孢他啶刺激下細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的變化,達(dá)到快速預(yù)測產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌藥敏結(jié)果的目的。
　　 方法:收集2005年11月-2006年2月大連市中心醫(yī)院臨床分離鑒定的120株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌,應(yīng)用whonet軟

4、件分析總體藥敏情況,提取大腸埃希菌細(xì)菌質(zhì)粒后,以常用ESBLs耐藥基因六對引物(TEM、SHV、CTX-M-Ⅰ、CTX-M-Ⅱ、CTX-M-Ⅲ、CTX-M-Ⅳ)做聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、擴(kuò)增產(chǎn)物用毛細(xì)管電泳法做基因型別分析。大腸埃希菌培養(yǎng)過程中加低劑量抗菌藥物頭孢他啶,運(yùn)用GC-MS方法,測定細(xì)菌胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的含量,采用聚類分析,判斷細(xì)菌藥敏情況。
　　 結(jié)果:大連市中心醫(yī)院對ESBLs大腸埃希菌最敏感的藥物是亞胺培南和美羅培

5、南,敏感率為100％,相對較敏感的抗生素有頭霉烯類的頭孢西丁,加酶抑制劑的哌拉西林/他唑巴坦和頭孢哌酮/舒巴坦,氨基糖苷類的阿米卡星。40株產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌中單基因型的分別為7株CTX-M-Ⅰ型占整體的17.5%,7株CTX-M-Ⅱ型占整體的17.5%,2株CTX-M-Ⅲ型占整體的5%,4株CTX-M－Ⅳ型占整體的10%,1株SHV型占整體的2.5%,1株TEM型占整體的2.5%。18株多基因型有占整體的46.15%,多數(shù)是CT

6、X-M型與SHV型或TEM型共同存在的形式;除此之外,有一株擴(kuò)增產(chǎn)物為陰性結(jié)果。所有菌株的細(xì)胞內(nèi)化合物分析可發(fā)現(xiàn)至少1500個化合物離子碎片信息,經(jīng)聚類分析,57株耐藥菌中,有5株被誤判;47株中敏菌中有8株被誤判;16株敏感菌中有2株被誤判?？傮w來說,本研究采用的方法GC-MS方法基本可以將敏感、耐藥和中敏的菌株區(qū)分開來。
　　 結(jié)論:本文建立的毛細(xì)管電泳法可以較快速的鑒別產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的基因型別,通過C-C-MS方法