腸道外致病性大腸埃希菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的耐藥性及基因分型.pdf

1、目的：了解福建地區(qū)腸道外致病性大腸埃希菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥現(xiàn)狀；調(diào)查本地區(qū)該菌的產(chǎn)超廣譜B內(nèi)酰胺酶情況，建立簡(jiǎn)便實(shí)用的快速檢測(cè)方法；明確本地區(qū)ESBLs相關(guān)編碼基因的基因型別及特征，為建立產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶ExPEC的分子流行病學(xué)篩查和臨床診斷方法奠定基礎(chǔ)。 方法：對(duì)2003年～2005年間從福建地區(qū)7家醫(yī)院收集的腸道外致病性大腸埃希菌用瓊脂稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。分別用終濃度為1μg／ml頭孢他定和頭孢噻肟對(duì)這些菌株進(jìn)行ESB

2、Ls初篩，任一底物檢測(cè)出現(xiàn)結(jié)果陽(yáng)性，就采用臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)推薦的表型確證試驗(yàn)確證之。同時(shí)設(shè)計(jì)肉湯微量稀釋法，先對(duì)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922(非產(chǎn)ESBLs菌株)和肺炎克雷伯菌ATCC700603(產(chǎn)ESBLs菌株)重復(fù)試驗(yàn)40次，驗(yàn)證其可靠性，再用該法檢測(cè)59株產(chǎn)ESBLs菌株和33株非ESBLs菌株，以CLSI推薦的表型確證試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，確定本研究建立的方法的真實(shí)性。用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)檢測(cè)產(chǎn)

3、ESBLs菌株的質(zhì)粒譜帶。設(shè)計(jì)通用引物，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)產(chǎn)酶株ESBLs相關(guān)編碼基因bla，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶PstI和PvuII酶切，運(yùn)用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析各菌株ESBLs的基因型別。 結(jié)果：本研究分離得到176株ExPEC，其中158株表現(xiàn)為多重耐藥，占全部菌株數(shù)的89．77％。85株對(duì)第三代頭孢類抗生素耐藥，占全部菌株數(shù)的48．30％。這些菌株對(duì)喹諾酮類和氨基糖苷類的耐藥率也分

4、別達(dá)76％和35％以上。腸道外致病性大腸埃希菌對(duì)第三代頭孢類抗生素和對(duì)氨基糖苷類及喹諾酮類抗菌藥物的耐藥存在一定的相關(guān)性。對(duì)ESBLs進(jìn)行初篩，得到74株ESBLs可疑陽(yáng)性菌，對(duì)其進(jìn)行表型確證試驗(yàn)，可以確證得到59株產(chǎn)ESBLs菌，故本地ESBLs菌的檢出率為33．52％。肉湯微量稀釋法重復(fù)檢測(cè)結(jié)果顯示，大腸埃希菌ATCC25922為非ESBLs菌的符合率為100％，肺炎克雷伯菌ATCC700603為產(chǎn)ESBLs菌的符合率也為1.00％

5、，可見(jiàn)該方法相當(dāng)可靠；真實(shí)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法的敏感度、特異度分別高達(dá)96．61％，100％，其觀察一致值可高達(dá)97．83％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100％。脈沖場(chǎng)凝膠電泳結(jié)果顯示，各產(chǎn)酶菌株具有多條質(zhì)粒譜帶，表明本研究ExPEC為非重復(fù)株。隨機(jī)抽樣的44株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中，38株經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可擴(kuò)增出大小為544bp的目的條帶，占所檢測(cè)的ESBLs菌株數(shù)的86．36％，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)RFLP分析發(fā)現(xiàn)，31株可被限制性核酸內(nèi)切酶Pvu

6、II切割成472bp和72bp兩個(gè)片段，表明其為CTX．M．14型ESBLs；7株可被限制性核酸內(nèi)切酶PvuII切割成267bp、156bp和121bp三個(gè)片段，屬于CTX．M．1亞群的ESBLs，其具體型別有待于進(jìn)一步鑒定。 結(jié)論：(1)腸道外致病性大腸埃希菌對(duì)常用抗生素的耐藥性已經(jīng)到了相當(dāng)嚴(yán)重的地步，必須采取措施有效控制。(2)多重耐藥菌的出現(xiàn)可能是抗生素選擇壓力所致。(3)本地區(qū)腸道外致病性大腸埃希菌中ESBLs的檢出率相

7、當(dāng)高，以CTX．M．14型為主，同時(shí)存在CTX．M．1亞群的ESBLs，它們的出現(xiàn)嚴(yán)重地威脅了本地醫(yī)院的抗感染治療，合理使用抗菌藥物以降低耐藥性和采取有效措施控制其傳播非常重要。(4)本研究建立的肉湯微量稀釋法確證ESBLs具有相當(dāng)高的真實(shí)性和可靠性，其效益分析也很好，可望在基層醫(yī)院的ESBLs耐藥性監(jiān)測(cè)工作中推廣使用。(5)本研究中采用的PCR-RFLP技術(shù)可快速、準(zhǔn)確、便捷地檢測(cè)ESBLs的編碼基因并確定它們的基因型，結(jié)果可靠，適于