紅景天苷類似物對缺氧所致EAhy926內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EAhy926為工具細(xì)胞，通過體外建立細(xì)胞缺氧損傷模型，研究紅景天苷類似物對EAhy926細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用，并探討其可能作用機(jī)制。
　　方法：
　　1紅景天苷類似物給藥濃度的確定及實(shí)驗(yàn)分組
　　1.1取對數(shù)生長期細(xì)胞，通過MTT實(shí)驗(yàn)、LDH活性測定，觀察紅景天苷類似物對EAhy926內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，并確定本實(shí)驗(yàn)中紅景天苷類似物的給藥濃度。
　　1.2實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為正常對照組（Con

2、trol）、缺氧模型組（Model）、紅景天陽性藥物組（H）及紅景天苷類似物干預(yù)組。
　　1.3通過剝奪培養(yǎng)介質(zhì)中的糖類和氧氣，同時(shí)用 N2取代正常培養(yǎng)環(huán)境中的O2，建立EAhy926內(nèi)皮細(xì)胞缺氧模型。
　　2紅景天苷類似物對缺氧所致EAhy926細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　2.1分別通過光鏡和 HE染色，觀察紅景天苷類似物對缺氧條件下EAhy926細(xì)胞形態(tài)改變的影響。
　　2.2通過臺(tái)盼藍(lán)染色，觀察紅景天苷類似物對

3、缺氧條件下 EAhy926細(xì)胞存活率的影響。
　　2.3通過硫代巴比妥酸法（TBA法）測定細(xì)胞內(nèi)丙二醛（MDA）含量、通過黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）檢測細(xì)胞內(nèi)總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力，觀察紅景天苷類似物對缺氧條件下EAhy926細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷的保護(hù)作用。
　　3紅景天苷類似物對缺氧所致EAhy926細(xì)胞損傷保護(hù)作用的機(jī)制探討
　　3.1采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性。

4、
　　3.2采用RT-PCR技術(shù)觀察各實(shí)驗(yàn)組HIF-1α mRNA、VEGF mRNA表達(dá)差異。
　　3.3采用Western Blot技術(shù)觀察各實(shí)驗(yàn)組HIF-1α、VEGF、pVHL蛋白表達(dá)差異。
　　結(jié)果：
　　1紅景天苷類似物給藥濃度的確定
　　MTT法檢測結(jié)果顯示，與正常對照組細(xì)胞（Control）比較，缺氧模型組細(xì)胞（Model）活力明顯降低（P<0.01）。與缺氧模型組細(xì)胞（Model）比較，經(jīng)

5、紅景天苷類似物（1×10-4~1×10-10mol·L-1）干預(yù)后，缺氧損傷細(xì)胞的活力均顯著增加（P<0.01）。其中，紅景天苷類似物1×10-6mol·L-1濃度組細(xì)胞活力較模型組增加最為明顯（ P<0.01）。紅景天苷類似物在1×10-6mol·L-1~1×10-10mol·L-1濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞活力呈藥物劑量相關(guān)性。
　　LDH活性結(jié)果顯示，與正常對照組細(xì)胞（Control）比較，缺氧模型組細(xì)胞（Model）LDH活性明顯升

6、高（P<0.01）。與缺氧模型組細(xì)胞（Model）比較，經(jīng)紅景天苷類似物（1×10-4~1×10-10mol·L-1）干預(yù)后，缺氧損傷細(xì)胞的 LDH活性均顯著降低（ P<0.01）。紅景天苷類似物在1×10-6mol·L-1~1×10-10mol·L-1濃度范圍內(nèi)，LDH活性隨藥物濃度降低而增加。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)中選用的紅景天苷類似物的高、中、低劑量分別為：1×10-6mol·L-1、1×10-7mol·L-1、1×10-8mo

7、l·L-1。
　　2紅景天苷類似物對缺氧所致EAhy926細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　2.1形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果
　　倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示，正常培養(yǎng)EAhy926細(xì)胞貼壁生長，呈鵝卵石樣鋪滿底層，胞體飽滿，細(xì)胞呈多角形或扁平短梭形。缺氧模型組細(xì)胞貼壁性較差，細(xì)胞皺縮、部分脫落。經(jīng)紅景天苷類似物和陽性藥物（紅景天苷）干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)得到明顯改善。
　　HE染色結(jié)果顯示，較正常對照組細(xì)胞，缺氧模型組細(xì)胞胞體變小，核固縮，

8、深染，部分細(xì)胞核腫大淡染，細(xì)胞間隙增大。紅景天苷類似物和陽性藥物（紅景天苷）干預(yù)后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)均顯著改善。
　　2.2臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果
　　通過臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示，與正常對照組細(xì)胞（Control）比較，缺氧模型組細(xì)胞（Model）存活率明顯降低（P<0.01）。與缺氧模型組細(xì)胞（Model）比較，經(jīng)紅景天苷類似物和陽性藥物（紅景天苷）干預(yù)后，缺氧損傷細(xì)胞的存活率均顯著升高（P<0.01）。
　　2.

9、3細(xì)胞內(nèi)T-SOD活性和MDA含量檢測結(jié)果
　　與正常對照組細(xì)胞（Control）比較，缺氧模型組細(xì)胞（Model）內(nèi)SOD活性顯著下降（P<0.01），MDA含量明顯增加（P<0.01）；與缺氧模型組（Model）比較，經(jīng)紅景天苷類似物和陽性藥物（紅景天苷）干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi) SOD活性顯著增加（P<0.01），MDA的產(chǎn)生明顯減少（高劑量P<0.01，中、低劑量P<0.05）。
　　3紅景天苷類似物對缺氧所致EAhy926細(xì)

10、胞損傷保護(hù)作用的機(jī)制探討
　　3.1 ELISA測定內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性結(jié)果
　　與正常對照組細(xì)胞(Control)比較，缺氧模型組細(xì)胞(Model)內(nèi) eNOS活性顯著下降(P<0.01)；與缺氧模型組(Model)比較，經(jīng)紅景天苷類似物和陽性藥物（紅景天苷）干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)eNOS活性顯著增加（P<0.01）。
　　3.2紅景天苷類似物對HIF相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響
　　RT-PCR結(jié)果顯示，

11、與正常對照組（Control）比較，缺氧模型組（Model） HIF-1α mRNA的表達(dá)量顯著增加（P<0.01），而VEGF mRNA的表達(dá)量則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與缺氧模型組（Model）相比，紅景天苷類似物干預(yù)組HIF-1α mRNA的表達(dá)量顯著下降（P<0.01），而VEGF mRNA的表達(dá)量明顯升高（P<0.01）。
　　3.3紅景天苷類似物對HIF相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響
　　Western Blot結(jié)果顯示，與正常對

12、照組（Control）比較，缺氧模型組（Model）HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平明顯增加（P<0.01）；pVHL蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）。與缺氧模型組（Model）相比，紅景天苷類似物和陽性藥物（紅景天苷）干預(yù)后，HIF-1α蛋白表達(dá)降低（P<0.01）；VEGF蛋白表達(dá)增加（陽性藥物、高劑量，P<0.01）；pVHL蛋白表達(dá)水平明顯增加（P<0.01）。
　　結(jié)論：紅景天苷類似物對缺氧所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具