基于mTOR靶標小豆蔻明調(diào)節(jié)糖代謝的研究.pdf

1、目的
　　 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）為胰島素信號通路中的重要調(diào)控因子，參與調(diào)節(jié)細胞代謝、增殖和生長。在胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）狀態(tài)下，過度活化的mTOR及其下游底物核糖體蛋白S6激酶1（ribosomAlS6 kinase 1，S6K1）可通過負反饋調(diào)節(jié)阻斷胰島素信號通路，導致糖代謝紊亂。小豆蔻明（Cardamonin，CAR）

2、能通過抑制mTOR活性逆轉(zhuǎn)高果糖誘導的IR大鼠血管增生性病變，同時改善整體動物IR狀態(tài)，降低空腹血清胰島素含量，增強胰島素敏感指數(shù)。本研究重點考察CAR對糖代謝過程中關(guān)鍵酶以及胰島素信號通路中關(guān)鍵信號分子的影響，深入探討CAR影響糖代謝的作用機制。
　　 方法
　　 1細胞培養(yǎng)
　　 采用組織貼塊方法原代培養(yǎng)血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells,vsMCs）。高糖高胰島素（2.

3、5×10-2 mol·L-1葡萄糖和100U·L-1胰島素）培養(yǎng)基誘導胰島素抵抗。
　　 2分組與給藥
　　 正常培養(yǎng)細胞設(shè)立正常對照組、0.1％ 二甲亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）溶劑對照組，高糖高胰島素誘導IR培養(yǎng)后，分別設(shè)立模型對照組、模型溶劑對照組（0.1％ DMSO），吡格列酮組（10-5 mol·L-1），RAP組（10-7 mol·L-1）及CAR組（10-6、10-5 mol·L-

4、1）；
　　 細胞以PA干預后，設(shè)正常對照組，溶劑對照組（0.1％ DMSO），RAP組（10-7 mol·L-1）及CAR組（10-6、10-5 mol·L-1）。
　　 3 測定指標及方法
　　 3.1己糖激酶法測定培養(yǎng)基中葡萄糖含量
　　 3.2 MTT法測定細胞增殖
　　 3.3 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶偶聯(lián)比色法測定己糖激酶活性
　　 3.4 硫酸蒽酮法測定細胞中糖原含量
　

5、　 3.5 Western Blot法檢測糖代謝相關(guān)信號分子葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（Glucose transporter 4，Glut4）、糖原合成酶激酶3（Glycogen synthase kinase-3，GSK-3）、己糖激酶（Hexokinase，HK）和胰島素信號通路中關(guān)鍵信號分子胰島素受體底物1（insulin receptor substrate，IRS-1）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、mTO

6、R、S6K1總蛋白蛋白及磷酸化蛋白的表達
　　 結(jié)果
　　 1高糖高胰島素培養(yǎng)VSMCs 72 h可誘導細胞產(chǎn)生胰島素抵抗，IR細胞平均葡萄糖消耗量、己糖激酶活性以及糖原含量顯著性降低（P<0.01）；
　　 2 CAR（10-5、10-6 mol·L-1）能增加胰島素抵抗VSMCs平均葡萄糖消耗量，增強己糖激酶活性以及細胞內(nèi)糖原合成（P<0.01），其中10-5 mol·L-1作用較強；
　　 3 CA

7、R能增加IR血管平滑肌細胞HK蛋白表達（P<0.01），抑制GSK-3β的表達，增強其磷酸化（P<0.01），但對Glut4的表達無明顯影響；
　　 4 CAR激活胰島素信號通路，增強IR血管平滑肌細胞IRS-1的蛋白表達及活化（P<0.01）；同時增強Akt的磷酸化（P<0.01），而對其總蛋白的表達無顯著性影響；
　　 5 CAR抑制mTOR和S6K1活化，顯著性降低p-mTOR、p-S6K1的蛋白表達（P<0.01