小豆蔻明抗多發(fā)性骨髓瘤多重效應(yīng)及其分子機(jī)制.pdf

1、第一部分、小豆蔻明抗多發(fā)性骨髓瘤的多重效應(yīng)
　　 目的：研究小豆蔻明對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞活性、增殖、凋亡、周期及其血管新生的作用并初步探討其作用機(jī)制。
　　 方法：采用MTT 法檢測(cè)天然藥物對(duì)骨髓瘤細(xì)胞活性的影響；采用CCK-8 法驗(yàn)證小豆蔻明對(duì)骨髓瘤細(xì)胞活性的作用；采用CCK-8 法檢測(cè)小豆蔻明對(duì)正常人單個(gè)核細(xì)胞（PBMNCs）活性的影響；采用EdU 法檢測(cè)小豆蔻明對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖的影響；采用碘化丙啶（PI）單染法流式細(xì)

2、胞術(shù)檢測(cè)小豆蔻明對(duì)骨髓瘤細(xì)胞周期的影響；采用Annexin V FITC/PI 雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小豆蔻明對(duì)骨髓瘤細(xì)胞凋亡的影響；采用吖啶橙（AO）、溴乙錠（EB）雙染熒光顯微鏡觀察小豆蔻明對(duì)骨髓瘤細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響；采用Western blot 檢測(cè)小豆蔻明對(duì)骨髓瘤細(xì)胞caspase-3和PARP 活化的影響；采用小管形成試驗(yàn)觀察小豆蔻明對(duì)血管新生的影響。
　　 結(jié)果：在篩選的4 種天然藥物中，小豆蔻明可以抑制骨髓瘤細(xì)胞的活

3、性；CCK-8實(shí)驗(yàn)也證實(shí)小豆蔻明可以呈時(shí)間和劑量依賴性抑制骨髓瘤細(xì)胞活性，小豆蔻明對(duì)RPMI 8226、U266、ARH-773 種骨髓瘤細(xì)胞48h IC50分別為14.69、13.06、10.82μM；而小豆蔻明對(duì)正常人PBMNCs的活性影響較小，只有在高達(dá)200μM 濃度時(shí)，才對(duì)PBMNCs 顯示出一定的毒性作用；EdU 試驗(yàn)顯示小豆蔻明可以明顯抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小豆蔻明可以將骨髓瘤細(xì)胞阻滯在G2/M 期，同時(shí)

4、可以顯著誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡；AO/EB 試驗(yàn)證實(shí)了小豆蔻明可以誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡；Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小豆蔻明可以誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞caspase-3和PARP 活化；小管形成試驗(yàn)顯示小豆蔻明可以抑制血管新生。
　　 結(jié)論：小豆蔻明顯示出抗骨髓瘤多重效應(yīng)，包括抑制骨髓瘤細(xì)胞活性與增殖、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)凋亡、抑制血管新生等。小豆蔻明誘導(dǎo)凋亡與caspase 激酶活化有關(guān)。小豆蔻明抗骨髓瘤值得進(jìn)一步深入研究。
　

5、　 第二部分、小豆蔻明調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤NF-κB 通路的機(jī)制
　　 目的：研究小豆蔻明對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞NF-κB 通路的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法：采用Western blot 檢測(cè)小豆蔻明對(duì)骨髓瘤細(xì)胞NF-κB 活化的影響；采用免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)小豆蔻明對(duì)骨髓瘤細(xì)胞NF-κB 亞細(xì)胞定位的影響；采用Western blot檢測(cè)小豆蔻明對(duì)骨髓瘤細(xì)胞NF-κB 上游IκBα活化、IKKα與IKKβ表達(dá)、AKT 活化的作用，研

6、究小豆蔻明對(duì)骨髓瘤細(xì)胞NF-κB下游抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、survivin、XIAP、cIAP-1、cIAP-2以及遷移相關(guān)蛋白ICAM-1、增殖相關(guān)蛋白COX-2和血管新生相關(guān)蛋白VEGF表達(dá)的影響；采用CCK-8 法觀察小豆蔻明聯(lián)合長(zhǎng)春新堿或地塞米松對(duì)骨髓瘤細(xì)胞活性的影響。
　　 結(jié)果：小豆蔻明可以呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性抑制骨髓瘤細(xì)胞NF-κB 亞基p65磷酸化；免疫熒光試驗(yàn)顯示小豆蔻明可以抑制骨髓瘤細(xì)胞NF

7、-κB 核轉(zhuǎn)位；Western blot結(jié)果顯示小豆蔻明可以下調(diào)NF-κB 上游IκBα磷酸化水平，呈時(shí)間和劑量依賴性抑制IKKα與IKKβ表達(dá)，下調(diào)AKT 活化水平。而且，小豆蔻明可以呈時(shí)間依賴性抑制NF-κB下游一系列基因產(chǎn)物的表達(dá)，包括抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、survivin、XIAP、cIAP-1、cIAP-2以及遷移相關(guān)蛋白ICAM-1、增殖相關(guān)蛋白COX-2和血管新生相關(guān)蛋白VEGF。CCK-8 試驗(yàn)顯示小豆蔻明

8、可以明顯提高長(zhǎng)春新堿和地塞米松對(duì)骨髓瘤細(xì)胞活性的抑制作用。
　　 結(jié)論：小豆蔻明通過(guò)下調(diào)NF-κB 上游AKT 活化、IKKα與IKKβ表達(dá)、IκBα活化，從而抑制NF-κB 活化，并進(jìn)一步抑制NF-κB下游與骨髓瘤發(fā)病相關(guān)蛋白的表達(dá)，這可能是小豆蔻明抗骨髓瘤多重效應(yīng)的分子機(jī)制之一。
　　 第三部分、小豆蔻明調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤STAT3 通路的機(jī)制
　　 目的：研究小豆蔻明對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞STAT3 通路的調(diào)控機(jī)

9、制。
　　 方法：采用ELISA 試驗(yàn)檢測(cè)小豆蔻明對(duì)骨髓瘤細(xì)胞IL-6分泌的影響；采用Westernblot 檢測(cè)小豆蔻明對(duì)骨髓瘤細(xì)胞STAT3 固有性活化的作用；采用免疫熒光試驗(yàn)觀察小豆蔻明對(duì)骨髓瘤細(xì)胞STAT3 亞細(xì)胞定位的影響；采用IL-6 刺激RPMI 8226細(xì)胞后，Western blot 檢測(cè)小豆蔻明對(duì)IL-6 誘導(dǎo)的STAT3 活化的影響，以及小豆蔻明對(duì)IL-6誘導(dǎo)的活化的影響；采用Western blot 檢測(cè)

10、小豆蔻明對(duì)骨髓瘤細(xì)胞STAT3下游基因產(chǎn)物cyclin D1、Bcl-2、VEGF表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：小豆蔻明呈時(shí)間依賴性抑制U266細(xì)胞IL-6的分泌；Western blot 顯示小豆蔻明可以呈時(shí)間和劑量依賴性抑制U266細(xì)胞STAT3 固有性的活化；免疫熒光試驗(yàn)顯示小豆蔻明可以抑制U266細(xì)胞STAT3 核轉(zhuǎn)位；Western blot 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-6 可以誘導(dǎo)RPMI 8226細(xì)胞STAT3 活化，而小豆蔻明可以