γ-GCS-GS(谷胱甘肽合成酶)在原核和真核細(xì)胞中的表達(dá)和重金屬耐受性研究.pdf

1、谷胱甘肽(GSH)是普遍存在于植物、動(dòng)物和其它生物體內(nèi)的活性三肽。分子結(jié)構(gòu)中的活性巰基具有重要的生物學(xué)功能,使其能絡(luò)合金屬離子,降低重金屬對(duì)細(xì)胞的毒害。且其作為一種抗氧化劑,能夠清除重金屬毒性產(chǎn)生的活性氧自由基。所以,提高GSH的含量能夠提高生物體對(duì)重金屬的耐受性。GSH是由谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和谷胱甘肽合成酶(GS)催化合成,但γ-GCS的催化活性受產(chǎn)物GSH的反饋抑制,使得細(xì)胞內(nèi)GSH含量維持在一定水平。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,

2、在某些革蘭氏陽(yáng)性菌中存在一種具有γ-GCS和GS兩種活性的雙功能融合蛋白γ-GCS-GS,研究發(fā)現(xiàn)該酶不受GSH的反饋抑制。所以該酶的表達(dá)能夠使細(xì)胞合成大量的GSH。
　　 本研究中,通過(guò)一系列生物信息學(xué)網(wǎng)站及軟件對(duì)嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)StGCS-GS基因編碼的γ-GCS-GS進(jìn)行預(yù)測(cè)分析表明,該蛋白分子量為85.1kD,理論等電點(diǎn)為4.90,平均疏水值為-0.268。該蛋白含有一個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn),且具有G

3、lu cys ligase和CPSase L D2亞家族保守域。同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌γ-GCS-GS的氨基酸序列與唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)、血鏈球菌(Streptococcus sanguinis)和無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)γ-GCS.GS序列的相似性分別為93％、73％和63％。進(jìn)化樹(shù)分析表明它們的親緣關(guān)系也相對(duì)較近。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明它們的γ-GCS-

4、GS具有相似的空間構(gòu)架,推測(cè)其行使相似的功能。
　　 為了研究StGCS-GS基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)情況及其在重金屬脅迫下的抗性功能,本實(shí)驗(yàn)將含有重組質(zhì)粒pETG-10A+GCS-GS的大腸桿菌通過(guò)IPTG誘導(dǎo),經(jīng)Ni2+-NTA親核層析柱純化后獲得了高純度的融合蛋白。經(jīng)Western blot檢測(cè),純化后的蛋白為His-γ-GCS-GS融合蛋白。對(duì)轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行不同濃度Cd2+、Ni2+、Cu2+脅迫的耐受性測(cè)試。結(jié)果發(fā)現(xiàn),

5、在1mM CdCl2、2mM NiSO4脅迫條件下,轉(zhuǎn)化大腸桿菌的生長(zhǎng)狀態(tài)明顯優(yōu)于對(duì)照,但在Cu2+脅迫條件下,兩者沒(méi)有明顯區(qū)別。表明StGCS-GS基因的表達(dá)能夠提高大腸桿菌對(duì)Cd、Ni的抗性,在其逆境脅迫下的生長(zhǎng)發(fā)揮重要作用。
　　 為了進(jìn)一步研究StGCS-GS基因是否賦予轉(zhuǎn)基因酵母在不同非生物脅迫下的抗性功能及其在酵母細(xì)胞中的表達(dá)定位情況,實(shí)驗(yàn)將StGCS-GS基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pYES2上,并轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(Sac

6、charomyces cerevisiae)INCSc1菌株中。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因酵母在不同脅迫培養(yǎng)基上的存活率。結(jié)果表明:在不同濃度的CdCl2、NiSO4及H2O2脅迫下,轉(zhuǎn)StGCS-GS基因的酵母的生長(zhǎng)狀態(tài)要好于對(duì)照。在CdCl2脅迫下表現(xiàn)的耐性更加明顯。但在CuCl2和Sorbitol脅迫下,并未表現(xiàn)出耐受性。這說(shuō)明StGCS-GS基因的表達(dá)使得轉(zhuǎn)基因酵母具有抗Cd、Ni及氧化脅迫的能力。此外,利用γ-GCS-GS-GFP融合蛋白對(duì)目

7、的蛋白進(jìn)行了表達(dá)定位研究,結(jié)果表明融合蛋白定位于酵母的細(xì)胞質(zhì)中。
　　 為了進(jìn)一步研究StGCS-GS基因的表達(dá)是否能提高高等植物的在重金屬脅迫下的耐受能力。實(shí)驗(yàn)對(duì)9個(gè)相互獨(dú)立并穩(wěn)定表達(dá)γ-GCS-GS的轉(zhuǎn)基因煙草T3代株系進(jìn)行了重金屬脅迫耐受性分析。通過(guò)對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因煙草在Cd、Ni、Cn脅迫后的根長(zhǎng)、鮮重及葉綠素的統(tǒng)計(jì)分析表明,在不同濃度的Cd2+和Ni2+脅迫下,轉(zhuǎn)基因煙草的生長(zhǎng)狀態(tài)都要優(yōu)于野生型。但在Cu2+脅迫下,轉(zhuǎn)