耐受性樹突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)和體內(nèi)誘導(dǎo)免疫耐受的研究.pdf

1、目的： 探索耐受性樹突狀細(xì)胞(tolerogenic dendritic cell，tDCs)的體外培養(yǎng)方法，觀察不同培養(yǎng)條件下tDCs的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表型及功能變化，在小鼠體內(nèi)建立tDCs誘導(dǎo)特異性免疫耐受方法，為tDCs在預(yù)防移植免疫排斥反應(yīng)和治療某些自身免疫性疾病的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 方法： 采用雄性Balb/c小鼠為供體，雌性昆明小鼠為受體。取供體小鼠骨髓細(xì)胞，分離單個核細(xì)胞。在含GM-CSF、IL-4

2、、VIP、DXM、LPS等因子的RPMI 1640培養(yǎng)基中按不同的組合分為五組進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)：空白組(不加任何因子)、常規(guī)DC組(GM-CSF+IL-4)、VIP-DC組(GM-CSF+VIP)、DXM-DC組(GM-CSF+DXM)、VIP+DXM-DC組(GM-CSF+VIP+DXM)。光鏡下動態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞CD80、CD86、CD40、CD11c表達(dá)，MTT法檢測DC刺激淋巴細(xì)胞增殖活性，ELISA法檢測DC

3、s培養(yǎng)上清液IL-10、IL-12表達(dá)水平。昆明小鼠體內(nèi)輸注實驗分四組：空白對照組(不經(jīng)任何處理)、骨髓細(xì)胞組(輸骨髓細(xì)胞)、常規(guī)DC組(輸常規(guī)培養(yǎng)DCs)、tDCs組(輸tDCs)。輸注細(xì)胞3天后移植供體脾片，移植后20天取移植脾片病理組織學(xué)檢查，移植后1月流式細(xì)胞術(shù)檢測受體脾單個核細(xì)胞CD80、CD86、CD40、CD11c和CD4+CD25+的表達(dá)。采用PKH26標(biāo)記tDCs進(jìn)行體內(nèi)定位的研究：輸PKH26標(biāo)記tDCs的受體，1月

4、后取肝、脾、淋巴結(jié)、移植脾片等印片或/和冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察PKH26標(biāo)記細(xì)胞存在數(shù)量。 結(jié)果： 1、利用GM-CSF、IL-4、VIP、DXM、LPS等因子體外培養(yǎng)能生成具有典型的樹枝狀突起DCs。常規(guī)DC組、VIP-DC組、DXM-DC組、VIP+DXM-Dc組CD11c的表達(dá)較高，與空白組比較有顯著性差異(P＜0.05)。 2、VIP-DC組、DXM-DC組、VIP+DXM-DC組CD40、CD80和

5、CD86表達(dá)，淋巴細(xì)胞增殖活性及培養(yǎng)上清液IL-12濃度均低于常規(guī)DC組(P＜0.05)，VIP組以濃度為40ng/ml、DXM組以10ng/ml減低明顯，其中VIP+DXM-DC組在VIP濃度為40ng/ml、DXM為10ng/ml條件下為最低，差異明顯(P＜0.05)。 3、VIP-DC組、DXM-Dc組、VIP+DXM-DC組細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中IL-10濃度均高于常規(guī)DC組(P＜0.05)，VIP組以濃度為40ng/ml，

6、DXM組以10ng/ml升高明顯，其中VIP+DXM-DC組在VIP濃度為40ng/ml、DXM為10ng/ml條件下為最高，差異明顯(P＜0.05)。 4、小鼠體內(nèi)tDCs輸注實驗：tDCs組的移植脾片大體形態(tài)呈灰紅色，與移植部位周圍組織建立血液供應(yīng)；病理學(xué)觀察組織結(jié)構(gòu)完整，未見明顯變性壞死，與正常脾組織結(jié)構(gòu)相似。而空白對照組、骨髓細(xì)胞組、常規(guī)DC組移植脾片大體呈灰白色、淺灰紅色、灰褐色，與周圍組織未建立血液供應(yīng)；病理學(xué)觀察組

7、織結(jié)構(gòu)受破壞，有的呈大片壞死。 5、tDCs組小鼠脾單個核細(xì)胞CD4+CD25+雙表達(dá)細(xì)胞為18.15±0.66％，比正常小鼠的6.5±0.55％高近3倍，有顯著性差異(P＜0.05)；CD40、CD11c、CD80、CD86的表達(dá)比正常小鼠低，有顯著性差異(P＜0.05)。 6、PKH126標(biāo)記tDCs體內(nèi)實驗：輸熒光染色tDCs受體小鼠的組織印片，脾臟的熒光細(xì)胞數(shù)量最多(44±3/HP)、肝臟次之(26±2/HP)、

8、淋巴結(jié)較少(3±1/HP)。冰凍切片顯示：脾臟的熒光細(xì)胞數(shù)量最多(43±3/HP)、肝臟次之(24±2/HP)、淋巴結(jié)較少(2±1/HP)。 結(jié)論: 1、小鼠骨髓單個核細(xì)胞，體外經(jīng)GM-CSF、VIP或/和DXM、LPS聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)生成致耐受性樹突狀細(xì)胞(tDCs)。 2、與GM-CSF、IL-4和LPS聯(lián)合常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)DCs方法比較，tDCs具有CD40、CD80、CD86表達(dá)低；刺激淋巴細(xì)胞增殖弱；tDCs培

9、養(yǎng)體系上清液IL-10水平高而IL-12水平低。 3、GM-CSF、VIP+DXM、LPS聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)生成tDCs效果較佳，其中以VIP40ng/ml、DXM10ng/ml的培養(yǎng)條件為最好。 4、在移植脾片小鼠模型，經(jīng)腹腔注射tDCs能誘導(dǎo)受體對移植器官產(chǎn)生特異性免疫耐受。 5、小鼠體內(nèi)輸注tDCs，其脾臟CD4+CD25+Treg細(xì)胞增高，CD11c、CD40、CD80、CD86表達(dá)降低。 6、腹腔注射