水稻蔗糖合成酶基因RNAi株系的構(gòu)建及原核表達.pdf

1、蔗糖作為高等植物體內(nèi)光合作用產(chǎn)出的主要物質(zhì)，同時也是碳水化合物轉(zhuǎn)運的主要形式，在植物體內(nèi)的長距離糖轉(zhuǎn)運中扮演重要角色并且起著信號分子的作用。研究認為同蔗糖代謝途徑有關(guān)的基本上有三類酶，分別是轉(zhuǎn)化酶(Inv)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖合成酶(SUS)，其中蔗糖合成酶具有分解蔗糖和合成蔗糖的作用，前者是蔗糖合成酶的主要作用即分解蔗糖為淀粉及纖維素合成提供前體。蔗糖合成酶還同糖的輸入，細胞壁合成及貯藏能力相關(guān)，這些功能都是通過蔗糖合成酶

2、對蔗糖分解水平的調(diào)控來實現(xiàn)。
　　對于蔗糖合成酶基因家族的研究表明，多種植物中蔗糖合成酶基因家族各成員的結(jié)構(gòu)存在一定的區(qū)別卻又高度相似，表達模式的分析證明家族內(nèi)所有成員有著各自不同的表達部位和時間，各個家族成員在植物生長的不同時期起著不同的作用，最終由家族的所有成員共同完成蔗糖合成酶代謝的相關(guān)功能，但是水稻蔗糖合成酶基因家族單個成員的功能目前還不明確，只有對其功能的推斷而缺少實際的實驗數(shù)據(jù)。
　　為了研究水稻蔗糖合成酶基因家

3、族各個成員的功能及相互作用，本文首先根據(jù)水稻蔗糖合成酶基因家族的已知cDNA序列設(shè)計引物，構(gòu)建了六個RNA干擾表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)PCR鑒定后共獲得了43棵陽性株系。經(jīng)過PCR分析證明目的基因穩(wěn)定存在于T1代轉(zhuǎn)基因植株基因組之中。T1代陽性植株隨機取樣進行RT-PCR分析，證實RNA干擾載體在T1代植株中表達并在轉(zhuǎn)錄水平上對基因功能產(chǎn)生了抑制效果，選取其中抑制效果明顯的株系進行純系篩

4、選并進行下一步的實驗，以期能通過純系的表型研究水稻蔗糖合成酶基因家族單個基因功能。
　　本文還通過對水稻蔗糖合成酶基因的原核表達條件的優(yōu)化確定了原核表達的條件，發(fā)現(xiàn)在16℃或者28℃搖床250rpm，IPTG濃度0.5mM誘導(dǎo)過夜等條件下，蛋白能穩(wěn)定的進行表達，但只有SUS1-pET24a誘導(dǎo)后能清楚地看到有可溶性蛋白。通過轉(zhuǎn)基因方法進行了愈傷組織中的熒光定位，進一步研究表達模式。以上實驗為水稻蔗糖合成酶的相關(guān)研究奠定了良好的基礎(chǔ)