豬硫辛酸合成酶Lias基因的克隆及其原核表達(dá).pdf

1、硫辛酸合成酶是一種廣泛存在于各種有機(jī)體中，它參與內(nèi)源性硫辛酸的合成。硫辛酸是一個有效的線粒體抗氧化劑，對有機(jī)體的能量代謝和抗氧化起到重要的作用。目前，人們已經(jīng)克隆了多種生物的硫辛酸合成酶基因，目前，關(guān)于硫辛酸生物學(xué)功能的研究已經(jīng)有許多，但硫辛酸在哺乳動物代謝的相關(guān)方面的研究相對較少，而與硫辛酸合成酶相關(guān)的研究就更少，至今還沒有與豬的硫辛酸合成酶基因相關(guān)的報道。
　　為進(jìn)一步研究豬Lias基因所編碼蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，本試驗基于電子

2、延伸序列，設(shè)計其克隆引物，利用RT-PCR方法成功克隆了豬Lias基因，并檢測了該基因在豬各組織中的分布情況。為了獲取Lias的蛋白質(zhì)分子，本試驗根據(jù)克隆序列合成一對表達(dá)引物，將豬Lias的ORF片段亞克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，經(jīng)菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定、測序鑒定。將獲得的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Lias轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，分別用不同終濃度的IPTG和不同的誘導(dǎo)表達(dá)時間進(jìn)行誘導(dǎo)，以確定蛋白

3、表達(dá)的最佳條件。在最佳誘導(dǎo)條件下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測。以鼠抗6×His標(biāo)簽單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗對Lias蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測。結(jié)果表明:
　　1.豬Lias的克隆、序列分析與組織分布。
　　克隆的豬Lias基因包含一個完整的開放閱讀框架，長度為1119bp，編碼由372個氨基酸組成的Lias蛋白，其中酸性氨基酸72個，堿性氨基酸65個，蛋白質(zhì)分子量為:41.58KDa，等電點為:9

4、.05。其氨基酸序列與小鼠、人鼠、人、牛同源性分別為91.5％、79.4％、89.4％、88.2％，Lias基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、十二指腸、空腸、直腸、回腸、脂肪、皮膚、肌肉中都有表達(dá)，Gel-Pro analyzer軟件分析后，主要在腎臟和脂肪中含量最高，其次是直腸和回腸。
　　2.豬pET-28a(+)-Lias重組蛋白的鑒定。
　　確定豬Lias基因插入的位置、大小和讀碼框均正確，證實成功構(gòu)建了原核表達(dá)載