不同真菌來源的ATP-檸檬酸裂解酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、ATP-檸檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL,EC2.3.3.8)是脂肪酸合成途徑外的一個關(guān)鍵酶,它能催化檸檬酸裂解成草酰乙酸和乙酰輔酶A。ACL的存在是微生物油脂積累的一個先決條件,本研究利用基因組步移法和常規(guī)PCR法從5種不同的真菌:粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)、斯達(dá)酵母(Lipomyces starkeyi)、高山被孢霉(Mortieralla alpine)、米曲霉(Aspergill

2、us oryzae)和核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)中分別克隆得到了acl基因,并分別在大腸桿菌和畢赤酵母中進(jìn)行了異源表達(dá),然后通過紫外分光光度計法測定酶活和氣相色譜分析測定脂肪酸含量的方法來對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行功能驗證。主要結(jié)果如下:
　　 (1)成功克隆得到了5種真菌來源的acl基因,其中利用基因組步移法克隆得到了在GenBank中未登錄的粘紅酵母和斯達(dá)酵母的acl基因編碼序列,且這兩種菌的acl基因序

3、列完全一致,包含有兩個亞基acl1(1953 bp)和acl2(1494 bp)。
　　 (2)成功將5種真菌來源的acl基因在大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE檢測表明粘紅酵母、斯達(dá)酵母、米曲霉和核盤菌的來源的acl基因表達(dá)后的ACL1和ACL2亞基的分子量大小都相似,分別約為66 kDa和55 kDa,高山被孢霉來源的acl基因表達(dá)后的ACL蛋白分子量大小約為120 kDa。
　

4、　 (3)對所有大腸桿菌表達(dá)后的ACL蛋白酶活力進(jìn)行了測定,結(jié)果表明粘紅酵母、斯達(dá)酵母的acl基因表達(dá)后具有最高的酶活力(4.2 U/mg),且只有當(dāng)ACL1和ACL2亞基都具備,摩爾比為1:1時才能使全酶的酶活力達(dá)到最大。
　　 (4)將粘紅酵母acl1和acl2基因在大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)中進(jìn)行共表達(dá),氣相色譜分析脂肪酸含量,結(jié)果表明重組菌株在誘導(dǎo)表達(dá)12 h時脂肪酸含量達(dá)到最大,為8.2％,較對照菌株

5、的提高量也達(dá)到最大的24.8％,提高效果十分顯著。
　　 (5)對粘紅酵母acl1和acl2基因在畢赤酵母GS115進(jìn)行表達(dá)研究,結(jié)果表明表達(dá)后全酶的酶活力為6.5 U/mg,較原核表達(dá)的酶活力提高了近55％,并確定了酶催化反應(yīng)的最佳條件為:pH8.5,37℃反應(yīng)10 min。
　　 本研究表明粘紅酵母和斯達(dá)酵母等油脂酵母類的acl基因可以利用基因工程手段對其表達(dá)量進(jìn)行調(diào)控,提高ACL酶活力,增強(qiáng)脂肪酸的合成。因此,油脂