幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及幾丁質(zhì)裂解酶基因的克隆與表達.pdf

1、幾丁質(zhì)(chitin)是由N-乙酰氨基葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵聚合而成的直鏈大分子，是大多數(shù)真菌細胞壁的組成成分，也廣泛存在于甲殼類動物和昆蟲的外殼以及昆蟲的中腸圍食膜中。幾丁質(zhì)酶作為幾丁質(zhì)這一主要生物多聚物的降解酶類，以其兼具抑制病原真菌生長和殺滅害蟲的雙重作用，且對動植物、人體無害，不污染環(huán)境的優(yōu)勢，而在植物病蟲害無公害防治方面極有研究和利用價值，本文針對幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的篩選、抗病測試、分類鑒定、基因克隆表達等方面進行了研究，結果

2、如下。 1.幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的分離篩選。利用平板稀釋分離法從土壤中分離到132株細菌和放線菌，用平板透明圈法篩選到32株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株，其中細菌20株，放線菌12株。幾丁質(zhì)酶活性較強的有編號為P6、C-10、9、F2、J4、J7、4-2、X菌株?；钚宰顝姷臑镕2菌株，其透明圈與菌落直徑比為3.14。對水稻紋枯病菌拮抗作用最強的細菌是C-10菌株，放線菌是P6菌株，抑菌帶分別為7mm和12mm。通過幾丁質(zhì)酶活性和抑菌活性強弱確定優(yōu)勢

3、拮抗菌株為P6、C-10和F2菌株。經(jīng)形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、細胞壁化學組分分析和生理生化分析，P6、C-10和F2菌株分別鑒定為球孢鏈霉菌(Streptomycesglobisporus)，短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，淺黃金桿菌(Aureobacteriumflavesnes)。這3個菌株均為新的幾丁質(zhì)裂解菌。 2.菌株對病原菌的拮抗試驗。以稻瘟病菌Magnaporthegrisea，水稻紋枯病菌Rhizoct

4、oniasolani頭孢霉Cephalosporiumsp.，小麥赤霉病菌Gibberellazeae，黃瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum，禾谷類鐮刀菌Fusariumgraminearum，西瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.niveum，茄子枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.Melongenae，辣椒炭疽病菌Colletotrichumgloeospo

5、rioides，馬尾菇枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.Coprinuscomatus，長蠕孢霉Helminthosporinm.sp11種病原真菌為指示菌，應用平皿拮抗法測定P6、F2、C-10菌株抑菌作用，顯示這3個菌株對大多數(shù)病原真菌具不同程度的抑制作用，其中P6菌株對水稻紋枯病菌Rhizoctoniasolani和辣椒炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides的抑制作用最強，抑菌帶均為1

6、2mm；C-10菌株對長蠕孢霉Helminthosporinm.sp的抑菌帶為10mm。 3.幾丁質(zhì)酶蛋白對病原菌的拮抗試驗。以辣椒炭疽病菌、水稻紋枯病菌、稻瘟病菌和黃瓜枯萎病菌4種病原真菌為病原指示菌，提取菌株P6、F2、C-10的粗蛋白做平皿抑菌測試，顯示P6、F2、C-10菌株粗蛋白對4種病原真菌均具拮抗活性，其中P6菌株對水稻紋枯病菌、辣椒炭疽病菌2種病原菌的拮抗活性較強，抑菌帶分別為7mm和6mm。 4.幾丁質(zhì)

7、酶基因克隆研究。通過建立DNA文庫的方法對C-10菌株進行了幾丁質(zhì)酶基因克隆研究。提取C-10菌株DNA，經(jīng)Sau3AI部分酶切后分離2-10kb的片段，插入PUC19的BamHI位點，轉化大腸桿菌(E.coliDH5a)，在幾丁質(zhì)平板上篩選陽性克隆。從菌株C-10的重組子中篩選到一個產(chǎn)透明圈的陽性克隆(命名為DHu)，提取其質(zhì)粒(質(zhì)粒命名為PUC-U)酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)該克隆插入片段大約2k，對該片段進行測序，結果表明該片段長為1637b

8、p，該序列命名為D1637。另外對P6和F2菌株也進行了幾丁質(zhì)酶基因克隆研究，從兩個菌株的大約5400個重組子中沒篩選到能產(chǎn)生水解圈的陽性克隆，估計是重組子數(shù)量不夠。 5.生物信息學研究。對D1637序列通過softberry分析結果表明，該序列預測一個基因，其CDS長為1176bp，編碼391個aa，將這一基因命名為ChiMC基因。利用DNAstar和predictprotein對蛋白質(zhì)進行分析，預測其一級序列包括33個堿性a

9、a，45個酸性，156個疏水a(chǎn)a，92個極性aa。利用softberry對氨基酸序列進行分析，預測蛋白質(zhì)二級結構包含17個a螺旋，10個β折疊。通過Swiss預測蛋白質(zhì)三維結構，結果顯示該蛋白含有三個明顯結構域，中央結構域包含一個鋅原子。 Ncbi-Blastn序列比對顯示有1216bp的一段區(qū)域與來自E.coli菌株的一段基因組DNA同源，其中與EscherichiacoliK-12MG1655菌株的基因組DNA同源性最高，達

10、100％。該菌株的這段序列為編碼磷酸甘露糖異構酶(phosphomannoseisomerase,PMI)的manAgene的編碼區(qū)。另一段350bp的序列與Cestrumyellowleafcurlingvirus(CmYLCV)的基因組DNA同源，同源性高達100％，該文獻對這段序列未做注釋。在以上2段區(qū)域之間以及D1637序列的一端分別有56bp和17bp的空白區(qū)域，在GeneBank里找不到同源序列。說明C-10菌株基因組DNA

11、的這段序列尚未在GeneBank里登錄。通過softberry對D1637序列進行啟動子預測，結果顯示在CmYLCV序列區(qū)域內(nèi)預測一個啟動子。利用Expasy軟件對蛋白質(zhì)進行預測，結果顯示該蛋白質(zhì)含有5個功能位點：N端?；稽c(N-myristoylationsite)、PKC磷酸化位點(ProteinkinaseCphosphorylattonsite)、酪蛋白激酶-Ⅱ磷酸化位點(CaseinkinaseⅡphosphorylati

12、onsit)、酪氨酸硫酸化位點(Tyrosinesulfationsite)、微生物羧基端定位信號位點(MicrobodiesC-terminaltargetingsignal)。通過Ncbi-Blastp、Smart、InterProScan3個蛋白質(zhì)預測軟件對該蛋白進行預測，結果顯示該蛋白具有一個保守PMItypeI域，PMI具有催化6-磷酸甘露糖和6-磷酸果糖間異構互換的功能。 6.PET-ChiMC原核表達載體的構建與轉

13、化表達。將ChiMC基因的CDS區(qū)插入PET-30a(+)表達載體，構建了PET-ChiMC原核表達載體，轉化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導培養(yǎng)1～3h后，SDS-PAGE顯示表達了大量目的蛋白。將表達產(chǎn)物點到幾丁質(zhì)平板上，培養(yǎng)3d后未出現(xiàn)透明圈，據(jù)此初步認為PMI本身不能降解幾丁質(zhì)。本試驗中克隆到的基因不同于一般的幾丁質(zhì)酶基因，結構上與大多數(shù)幾丁質(zhì)酶基因沒有同源性，可能是一種獨特的幾丁質(zhì)酶基因。 7.基因功能驗證。將重組大腸

14、桿菌DHu做平板抑菌試驗，結果表明DHu菌株對小麥赤霉病病原菌有明顯抑制作用。其發(fā)酵液做室內(nèi)殺蟲試驗結果顯示，能顯著提高Bt工程菌DHF10對菜青蟲的的殺蟲效率，使害蟲集中死亡時間提前大約30h，而菌株DHu發(fā)酵液單獨對害蟲無殺滅效果。 8.幾丁質(zhì)酶蛋白的活性檢測。用幾丁質(zhì)誘導發(fā)酵P6、F2、C-10以及DHu菌株，發(fā)酵液應用硫酸銨沉淀法提取粗蛋白，充分透析后在幾丁質(zhì)平板上呈現(xiàn)明顯透明圈，未經(jīng)幾丁質(zhì)誘導的P6、F2、C-10菌株