基于轉(zhuǎn)錄組分析的菜蛾盤(pán)絨繭蜂畸形細(xì)胞調(diào)控寄主的分子機(jī)制研究.pdf

1、1、菜蛾盤(pán)絨繭蜂畸形細(xì)胞的發(fā)育和形態(tài)
　　 菜蛾盤(pán)絨繭蜂寄生寄主小菜蛾36h后，其胚胎兩端的漿膜層開(kāi)始解離形成畸形細(xì)胞，并在寄生48h后寄生蜂卵孵化時(shí)擴(kuò)散到寄主血淋巴中。寄生2d后解剖，每頭寄生后的小菜蛾獲得畸形細(xì)胞94±7個(gè)，寄生5d后達(dá)到最大值144±13個(gè)，此后開(kāi)始下降直至幼蜂在寄主體內(nèi)發(fā)育結(jié)束;初產(chǎn)生的細(xì)胞直徑15.05±0.73μm，并持續(xù)增大，至寄生后7d后達(dá)到最大值57.49±5.38μm，寄生8d后略有減小;光學(xué)

2、顯微鏡和掃描電鏡的觀察結(jié)果顯示畸形細(xì)胞在不同的發(fā)育時(shí)期均為近球形，體積不斷增大，微絨毛分布規(guī)則且密度持續(xù)增大。離體培養(yǎng)時(shí)，寄生2d后每個(gè)寄生蜂胚胎產(chǎn)生畸形細(xì)胞96±8個(gè)，寄生6d后達(dá)到最大值151±10個(gè)并維持這一水平直至寄生8d后;初產(chǎn)生的畸形細(xì)胞直徑16.14±0.98μm，并在發(fā)育過(guò)程中維持這一水平;光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡的觀察結(jié)果顯示離體培養(yǎng)的畸形細(xì)胞初產(chǎn)生時(shí)近球形，發(fā)育過(guò)程中形狀逐漸變得不規(guī)則，體積增長(zhǎng)趨勢(shì)不明顯，細(xì)胞表面微絨毛

3、較為稀疏，分布雜亂。
　　 2、菜蛾盤(pán)絨繭蜂畸形細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)定和分析
　　 菜蛾盤(pán)絨繭蜂畸形細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共產(chǎn)生總堿基數(shù)為1，254，124，980的6，967，361條reads、233，765個(gè)contig、38，706個(gè)scaffold和24，165個(gè)unigene。分別對(duì)contig、scaffold和unigene長(zhǎng)度的分布進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)序列長(zhǎng)度小于400bp。Nr注釋結(jié)果顯示共有63.5％的unig

4、ene（15，340個(gè)）比對(duì)上數(shù)據(jù)庫(kù)中的15，043個(gè)已知基因?？勺⑨屝蛄兄?9％的比對(duì)結(jié)果E值介于1.0E-50到1.0E-5之間;相似度的分析發(fā)現(xiàn)44％的序列與比對(duì)上序列的相似度介于60％-80％之間;對(duì)比對(duì)上的已知序列47％來(lái)自于黑腹果蠅、西方蜜蜂、岡比亞按蚊和麗蠅蛹集金小蜂。
　　 根據(jù)基因注釋的結(jié)果，畸形細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得序列鑒定得到以下類(lèi)群功能基因:①寄生蜂幼蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)攝取的相關(guān)基因，主要包括trehalase、matr

5、ixmetalloproteinase14、fatty acid binding protein和hexamerin等;②對(duì)寄主生理調(diào)控的相關(guān)基因，如gamma-glutamyl cyclotransferase-like venom protein、juvenilehormone esterase、teratocytes secreted protein14、venom protein8、endochitinase和cysteine-

6、rich/pacifastin venom protein等;（③抑制寄主免疫的相關(guān)基因，主要包括venom protein Vn4.6、venom protein Vn50、C-type lectin等;④毒素基因，主要包括venom allergen5和venom acid phosphatase A2;⑤抗菌肽基因，包括definsin等;⑥微絨毛組裝的相關(guān)基因，主要包括ezrin-radixin-moesin、supervill

7、in和fambrin等。
　　 3、菜蛾盤(pán)絨繭蜂畸形細(xì)胞的數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序
　　 1、3、5日齡畸形細(xì)胞（teratocytes-1d、teratocytes-3d和teratocytes-5d）的數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序分別得到5，895，449、6，272，972和6，214，769條reads，比對(duì)上轉(zhuǎn)錄組中的序列數(shù)分別為14，504、11，772和13，917個(gè)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)teratocytes-1d和terat

8、ocytes-5d相關(guān)性最小。GO注釋結(jié)果顯示，比對(duì)結(jié)果為cellkilling、protein tag的基因只在3日齡畸形細(xì)胞中表達(dá)，比對(duì)結(jié)果為nutrientreservoir activity的基因只在3日齡和5日齡畸形細(xì)胞中表達(dá)，比對(duì)上其他功能類(lèi)別的基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)較為類(lèi)似。
　　 功能基因表達(dá)模式研究發(fā)現(xiàn)，寄生蜂幼蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)攝取相關(guān)基因中trehalase前期表達(dá)量很高，并隨著細(xì)胞的發(fā)育逐漸降低;matrix me

9、talloproteinase14基本在細(xì)胞發(fā)育后期表達(dá)，fatty acid binding protein則細(xì)胞發(fā)育早期表達(dá)量較高，并逐漸降低;hexamerin基因隨細(xì)胞發(fā)育表達(dá)量逐漸增加。涉及對(duì)寄主發(fā)育調(diào)控的6類(lèi)基因有3種表達(dá)模式，juvenile hormone esterase和teratocytes secreted protein14在細(xì)胞發(fā)育前期有較高的表達(dá)，其他發(fā)育階段表達(dá)量較低;venom protein8和cys

10、teine-rich/pacifastin venom protein只在細(xì)胞發(fā)育末期表達(dá);gamma-glutamylcyclotransferase-like venom protein和endochitinase在細(xì)胞發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)水平相差不多。抑制寄主免疫相關(guān)基因、抗菌肽和毒素基因主要在細(xì)胞發(fā)育后期表達(dá)。涉及微絨毛組裝的基因細(xì)胞發(fā)育前期和中期表達(dá)水平較高，后期有所降低。
　　 4、寄生蜂幼蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)攝取相關(guān)基因的克隆和表達(dá)

11、
　　 用qPCR對(duì)unigene19276(trehalase)、unigene5800(matrix metalloproteinase14)、unigene20417(fatty acid binding protein)和unigene10893(hexamerin)的表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)unigene19276主要在前期（2日齡畸形細(xì)胞）表達(dá)，而unigene5800則主要在后期（5日齡畸形細(xì)胞）表達(dá)，unigene

12、10893的表達(dá)量呈逐漸緩慢增加的趨勢(shì)，unigene20417在發(fā)育早期（1-4日齡畸形細(xì)胞）發(fā)育過(guò)程中表達(dá)較為穩(wěn)定，后期（5日齡畸形細(xì)胞)略有降低。
　　 克隆得到unigene5800的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為MMP-14，基因序列全長(zhǎng)2，052bp，1，791bp的開(kāi)放閱讀框編碼一個(gè)66.35kD的蛋白;N末端有一個(gè)信號(hào)錨序列;氨基酸序列上分布有3個(gè)保守功能域，依次為PG_binding_1 s、ZnMc_ MMP和HX

13、;構(gòu)建表達(dá)載體pET-28-MMP-14并原核表達(dá)得到一個(gè)大于70kD的蛋白。
　　 5、調(diào)控寄主發(fā)育相關(guān)基因的克隆和表達(dá)
　　 用qPCR對(duì)unigene4760(gamma-glutamyl cyclotransferase-like venomprotein)、unigene14814(juvenile hormone esterase)、unigene17429(teratocytessecreted prote

14、in14)、unigene20419(venom protein8)、unigene20917(endochitinase)和unigene18359(cysteine-rich/pacifastin venom protein)的表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證。Unigene4760在4、5日齡時(shí)表達(dá)量顯著高于1、2日齡;unigene14814和unigene17429在1日齡時(shí)的表達(dá)量均顯著高于其它時(shí)期，unigene17429在4日齡時(shí)也有一

15、個(gè)表達(dá)高峰;unigene20419、unigene20917和unigene18359在5日齡時(shí)的表達(dá)量顯著高于其它時(shí)期。
　　 對(duì)unigene4760和unigene17429進(jìn)行克隆，得到兩個(gè)全長(zhǎng)分別為665bp和585bp的基因序列，命名為T(mén)SVP-GGCT和TSP-13。TSVP-GGCT包含一個(gè)558bp的開(kāi)放閱讀框，編碼分子量21.37kD的蛋白;無(wú)信號(hào)肽;含有一個(gè)GGCT_ like功能域;構(gòu)建表達(dá)載體pET-

16、28-TSVP-GGCT并原核表達(dá)得到一個(gè)26kD左右的蛋白，制備的多克隆抗體可以與菜蛾盤(pán)絨繭蜂毒液蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)。TSP-13基因342bp的開(kāi)放讀碼框編碼一個(gè)12.9kD的蛋白質(zhì)，有信號(hào)肽序列，無(wú)保守功能域，構(gòu)建表達(dá)載體pET-32-TSP-13但沒(méi)有表達(dá)出相應(yīng)的蛋白。
　　 6、抑制寄主免疫相關(guān)基因的克隆和表達(dá)
　　 qPCR對(duì)unigene20181(venom protein Vn4.6)、unigene23

17、309(venom proteinVn50)和unigene20101(C-type lectin)的基因表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)主要在細(xì)胞發(fā)育后期表達(dá)。
　　 克隆得到unigene20181、unigene23309、unigene23761等3個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)序列，分別命名為T(mén)SVP-8、TSVP-42和TSVP-SEP。TSVP-8的cDNA全長(zhǎng)為454bp，含有一個(gè)216bp的開(kāi)放讀碼框，編碼分子量為7.97kD的蛋白

18、質(zhì);有信號(hào)肽序列;無(wú)保守功能域。TSVP-42的cDNA全長(zhǎng)為1314bp，含有一個(gè)1143bp的開(kāi)放讀碼框，編碼分子量為41.94kD的蛋白質(zhì);無(wú)信號(hào)肽序列;包含一個(gè)Tryp_SPc保守功能域。TSVP-SEP的cDNA全長(zhǎng)為1389bp，含有一個(gè)1116bp的開(kāi)放讀碼框，編碼分子量為40.68kD的蛋白質(zhì)，有信號(hào)肽序列，包含一個(gè)Tryp_SPc保守功能域。構(gòu)建表達(dá)載體pET32-TSVP-8和pET28-TSVP-42分別表達(dá)出一個(gè)

19、小于26kD和大于43kD的蛋白質(zhì)，pET28-TSVP-SEP則未表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)。重組蛋白制備多克隆抗體可以與菜蛾盤(pán)絨繭蜂的毒液蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TSVP-8原核表達(dá)蛋白可以抑制寄主血淋巴的黑化。
　　 7、毒素基因的克隆和表達(dá)
　　 用qPCR對(duì)unigene8816(venom allergen5)和unigene19070(venom acidphosphatase A2)的基因表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證

20、，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因均以細(xì)胞發(fā)育后期表達(dá)為主。
　　 克隆unigene8816的cDNA得到一個(gè)全長(zhǎng)1085bp的序列，命名為T(mén)SVP-allergen，含有一個(gè)長(zhǎng)825bp的開(kāi)放讀碼框，編碼分子量為30.8kD的蛋白質(zhì)，有信號(hào)肽序列，包含一個(gè)屬于SCP超家族的保守功能域。構(gòu)建表達(dá)載體pET-TSVP-allergen并原核表達(dá)得到一個(gè)55kD左右的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)純化后制備得到的多克隆抗體可以與菜蛾盤(pán)絨繭蜂的毒液蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)。