菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞肽聚糖識(shí)別蛋白和抗菌肽基因的克隆與功能初探.pdf

1、寄生蜂利用多種寄生因子對(duì)寄主的免疫系統(tǒng)、生長發(fā)育及營養(yǎng)代謝進(jìn)行調(diào)控，為幼蜂提供良好的生長發(fā)育環(huán)境。作為主要寄生因子之一的畸形細(xì)胞，來源于寄生蜂胚胎的漿膜層細(xì)胞，幼蜂孵化時(shí)被釋放到寄主血腔中，在調(diào)控寄主生長發(fā)育和營養(yǎng)代謝等生理過程中發(fā)揮了重要作用?？咕氖抢ハx先天免疫系統(tǒng)中非常重要的一類效應(yīng)分子，是昆蟲受到外界微生物侵害時(shí)，昆蟲體內(nèi)一些組織或器官中大量迅速合成并釋放出具有生物活性的物質(zhì)，能殺死細(xì)菌、真菌、病毒甚至腫瘤細(xì)胞。本論文首先在篩選

2、出18個(gè)菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞免疫相關(guān)基因EST序列的基礎(chǔ)上，克隆了其中6個(gè)免疫相關(guān)基因，并測定了它們在不同微生物誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄模式;其次，對(duì)菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞所產(chǎn)生抗菌肽的抑菌活性以及畸形細(xì)胞與寄主感菌后死亡率的關(guān)系進(jìn)行了初步研究?，F(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　(1)免疫相關(guān)基因的篩選與驗(yàn)證
　　根據(jù)菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中基因注釋的結(jié)果，結(jié)合生物信息學(xué)分析，篩選出可以匹配到已知的10個(gè)免疫相關(guān)基因家族的18個(gè)EST序列。

3、通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT—PCR)驗(yàn)證了其中包括防御素defensin、溶菌酶lysozyme、膜翅肽hymenoptaecin、肽聚糖識(shí)別蛋白peptidoglycan-recognition protein(PGRP)等在內(nèi)的15個(gè)基因。
　　(2)菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞肽聚糖識(shí)別蛋白和抗菌肽基因的克隆與序列分析
　　通過RACE等技術(shù)手段，獲得了包括菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞防御素(CvTdef)、菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞肽聚糖識(shí)別

4、蛋白(CvTpgrp)和菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞甲殼肽（CvTcru）在內(nèi)的3種免疫相關(guān)基因家族的6條cDNA全長序列。其中，CvTdef-A含有長度為369bp的開放閱讀框(ORF)，編碼1個(gè)123個(gè)氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測分子量大約為13.25kDa;CvTdef-B含有長度為222bp的開放閱讀框，編碼1個(gè)74個(gè)氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測分子量大約為7.97kDa; CvTdef-C含有長度為237bp的開放閱讀框，編碼1個(gè)79個(gè)氨基酸殘基

5、的蛋白，預(yù)測分子量大約為8.56kDa; CvTpgrp-SA含有長度為336bp的開放閱讀框，編碼1個(gè)112個(gè)氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測分子量大約為12.69kDa; CvTpgrp-LC含有長度為525bp的開放閱讀框，編碼1個(gè)175個(gè)氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測分子量大約為35.29kDa;CvTcru含有長度為426bp的開放閱讀框，編碼1個(gè)142個(gè)氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測分子量大約為16.39kDa。序列分析結(jié)果表明:CvTdef-A、C

6、vTdef-B、CvTdef-C均含有信號(hào)肽序列和6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)。
　　(3)微生物誘導(dǎo)下菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞肽聚糖識(shí)別蛋白和抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄模式
　　在菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞體外培養(yǎng)的體系中加入熱滅活的大腸桿菌Escherichia coli、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis和白色念珠菌Monilia albican進(jìn)行體外免疫誘導(dǎo)。誘導(dǎo)6h、12h、24h、48h后提取各種處理?xiàng)l件下畸形細(xì)胞的總RNA

7、并合成cDNA，以熒光定量PCR(qRT-PCR)的方法檢測CvTdef、 CvTpgrp和CvTcru的轉(zhuǎn)錄水平。經(jīng)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌誘導(dǎo)處理后，6個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯地提高并隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長而繼續(xù)上升，而這種轉(zhuǎn)錄水平上升的幅度是誘導(dǎo)早期高于誘導(dǎo)晚期。不同菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞肽聚糖識(shí)別蛋白和抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄水平與不同微生物誘導(dǎo)的相關(guān)性不同:CvTde-A、CvTde-B、CvTde-C和CvTpgrp-SA經(jīng)細(xì)菌誘導(dǎo)

8、后轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于真菌誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄水平，CvTpgrp-LC在細(xì)菌、真菌誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)錄水平較為接近;CvTcru經(jīng)革蘭氏陽性菌誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄量上升水平高于革蘭氏陰性菌和真菌誘導(dǎo)。比較3個(gè)CvTdef在不同微生物誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄水平，從高到低依次為CvTdef-C＞CvTdef-B＞ CvTdef-A。CvTpgrp-LC在3種微生物誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平均高于CvTpgrp-SA。
　　(4) CvTdef-A的抑菌活性及畸形細(xì)胞與寄主幼蟲感菌后

9、死亡率的關(guān)系初探
　　以菌液生長曲線測定法測定了人工合成的CvTdef-A多肽的抑菌活性，結(jié)果表明CvTdef-A多肽對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長都具有抑制作用，且對(duì)于大腸桿菌生長的抑制作用強(qiáng)于對(duì)枯草芽孢桿菌生長的抑制作用。
　　通過比較菜蛾盤絨繭蜂雌蜂正常寄生、輻射不育菜蛾盤絨繭蜂雌蜂假寄生和未寄生的小菜蛾3齡中期幼蟲在大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌Pseudomonas aeruginosa、、金黃色葡萄球菌Staphylo