菜蛾盤(pán)絨繭蜂熱激蛋白基因的克隆及表達(dá)研究.pdf

1、熱激蛋白(heat shock proteins，HSPs)又稱熱休克蛋白，是生物體在受熱或其他因素作用下產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子，與生物的發(fā)育和抗逆密切相關(guān)。
　　 本研究克隆了菜蛾盤(pán)絨繭蜂Cotesia vestalis體內(nèi)4個(gè)hsps基因，并研究了菜蛾盤(pán)絨繭蜂hsps與發(fā)育的關(guān)系以及高溫脅迫下菜蛾盤(pán)絨繭蜂及其寄主小菜蛾P(guān)lutella xylostella的hsps表達(dá)模式。現(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　 1)菜蛾盤(pán)絨繭蜂h

2、sps的克隆及其序列分析
　　 通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、PCR、RT-PCR、RACE等技術(shù)和手段，共獲得菜蛾盤(pán)絨繭蜂4個(gè)hsps的cDNA和基因組DNA序列，涉及3個(gè)熱激蛋白家族。
　　 Cvhsp40的cDNA全長(zhǎng)1473bp，其中包含長(zhǎng)度為1068bp的ORF，可翻譯成長(zhǎng)度為355個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其理論分子量為39.1kDa，基因組序列內(nèi)不含內(nèi)含子。Cvhsp70的cDNA全長(zhǎng)2151bp，其中包含長(zhǎng)度為1938bp的O

3、RF，可翻譯成長(zhǎng)度為645個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其理論分子量為70.1kDa，基因組序列內(nèi)不含內(nèi)含子。Cvhsc70的cDNA全長(zhǎng)2327bp，其中包含長(zhǎng)度為1956bp的ORF，可翻譯成長(zhǎng)度為651個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其理論分子量為71.2kDa，基因組序列內(nèi)含有兩個(gè)內(nèi)含子。Cvhsp90的cDNA全長(zhǎng)2663bp，其中包含長(zhǎng)度為2172bp的ORF，可翻譯成長(zhǎng)度為723個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其理論分子量為83.3kDa，基因組序列內(nèi)不含內(nèi)含子

4、。
　　 2)菜蛾盤(pán)絨繭蜂不同發(fā)育時(shí)期hsps的表達(dá)規(guī)律
　　 通過(guò)特異性引物和熒光定量PCR方法分別檢測(cè)了菜蛾盤(pán)絨繭蜂4個(gè)hsps在不同發(fā)育時(shí)期（1齡末幼蜂、2齡初幼蜂、2齡末幼蜂、3齡幼蜂（結(jié)繭后1天）、蛹（結(jié)繭后4天）、初羽化雌蜂和初羽化雄蜂）的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明Cvhsp40和Cvhsc70的表達(dá)規(guī)律是隨著發(fā)育的進(jìn)程先降低再升高，Cvhsp70的表達(dá)規(guī)律是隨著發(fā)育的進(jìn)程先升高再降低，Cvhsp90的表達(dá)規(guī)律是隨著

5、發(fā)育的進(jìn)程先降低再升高再降低。同時(shí)，Cvhsp40和Cvhsc70在雌成蟲(chóng)中表達(dá)量最高，Cvhsp70在蛹中表達(dá)量最高，Cvhsp90在1齡幼蟲(chóng)和3齡幼蟲(chóng)中表達(dá)量最高。
　　 3)高溫脅迫條件下菜蛾盤(pán)絨繭蜂及其寄主小菜蛾hsps的表達(dá)模式
　　 通過(guò)特異性引物和熒光定量PCR方法分別檢測(cè)了菜蛾盤(pán)絨繭蜂1齡幼蜂、2齡初幼蜂、2齡末幼蜂、3齡幼蜂（結(jié)繭后1天）、蛹（結(jié)繭后4天）、初羽化雌蜂和初羽化雄蜂以及寄主小菜蛾的4個(gè)hs

6、ps在高溫脅迫（27～42℃處理1h，24℃恢復(fù)1h）下表達(dá)規(guī)律，24℃放置2h作為對(duì)照。結(jié)果表明，熱脅迫條件下不同發(fā)育時(shí)期的菜蛾盤(pán)絨繭蜂hsps表達(dá)模式不一樣，總體趨勢(shì)是隨溫度上升hsps表達(dá)量上升，但是在菜蛾盤(pán)絨繭蜂2齡初幼蜂中hsp40和hsp90的表達(dá)量在32℃處理顯著下降;hsc70的表達(dá)量在27℃、32℃處理顯著低于在24℃對(duì)照處理，這可能與寄生蜂和寄主間相互作用相關(guān)。
　　 在24℃條件下，菜蛾盤(pán)絨繭蜂的寄生可以誘

7、導(dǎo)小菜蛾4齡初幼蟲(chóng)hsc70和4齡中小菜蛾幼蟲(chóng)hsp70、hsc70、hsp90的表達(dá)量的升高。而在高溫和寄生的同時(shí)作用時(shí)，hsps的表達(dá)模式變化較大，被寄生小菜蛾4齡初幼蟲(chóng)hsp40、hsp70，以及4齡中幼蟲(chóng)hsp40的Tmax（誘導(dǎo)hsps表達(dá)量達(dá)到最高值的溫度）比在相對(duì)應(yīng)的未寄生小菜蛾中高5℃;其他齡期未寄生與被寄生小菜蛾hsps的Tmax基本一致，說(shuō)明了在寄生蜂發(fā)育的初期和中期，寄生能誘導(dǎo)寄主hsps表達(dá)并引起寄主抗熱性增強(qiáng)，