穿心蓮內(nèi)酯生物合成中萜烯合酶基因的克隆及功能鑒定.pdf

1、穿心蓮具有清熱解毒、涼血、消腫的功效，是很好的抗菌消炎藥。其主要的藥效成分為二萜類化合物穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯，但其生物合成途徑仍不清楚。穿心蓮內(nèi)酯的生物合成非常復(fù)雜，催化生成半日花烷型母核結(jié)構(gòu)的ent-柯巴基焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase，簡(jiǎn)稱ApCPS)是其關(guān)鍵限速酶。近期有報(bào)道，從穿心蓮中克隆得到了一個(gè)CPS基因(GenBank: JN216843.1)，但其功能并未得到驗(yàn)證。本研

2、究從植物體內(nèi)和體外兩個(gè)方面來(lái)鑒定該CPS的功能。ApCPS作為穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑中的早期調(diào)控基因，鑒定其生物功能可助我們了解穿心蓮內(nèi)酯類生物合成機(jī)制，也為將來(lái)利用該基因調(diào)控穿心蓮內(nèi)酯的生物合成，提高穿心蓮的藥效和規(guī)范化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。
　　本研究以種植在人工氣候室的穿心蓮為材料，使用RT-PCR檢測(cè)ApCPS的組織特異性表達(dá)，采用TLC和HPLC法測(cè)定各組織中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量。利用大腸桿菌代謝工程鑒定ApCPS在

3、體外的功能，并通過(guò)定點(diǎn)突變及生物信息學(xué)分析確定ApCPS的催化活性位點(diǎn);在植物體內(nèi)采用VIGS沉默ApCPS基因，作者采用RACE技術(shù)克隆得到了一個(gè)穿心蓮中的八氫番茄紅素脫氫酶基因(ApPDS)作為VIGS的報(bào)告基因，通過(guò)RT-PCR和qRT-PCR分析基因沉默的效果及穿心蓮內(nèi)酯生物合成上游關(guān)鍵酶3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)，1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)以及牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸合成酶(GGPS)的基因表達(dá)

4、情況，并使用HPLC法檢測(cè)ApCPS沉默后穿心蓮內(nèi)酯積累量的變化。同時(shí)，為了深入分析ApCPS在穿心蓮內(nèi)酯生物合成的功能，作者還檢測(cè)了在茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)下ApCPS及其上游相關(guān)基因的表達(dá)模式。本論文的主要研究結(jié)果如下:
　　1.ApCPS在各組織中均表達(dá)，在葉、莖中表達(dá)較高，根中表達(dá)最低，和穿心蓮內(nèi)酯在各組織中的積累情況一致。MeJA能誘導(dǎo)ApCPS表達(dá)強(qiáng)烈上調(diào)，穿心蓮內(nèi)酯生物合成上游基因HMGR、DXS、GGPS也受M

5、eJA誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，并且響應(yīng)時(shí)間要早于ApCPS，表明穿心蓮內(nèi)酯生物合成基因受到MeJA的廣泛調(diào)控。
　　2.作者從穿心蓮幼苗中克隆得到了ApCPS基因，重組表達(dá)確定ApCPS催化GGPP生成ent-CPP。將其保守域DXDD進(jìn)行定點(diǎn)突變后，ApCPS失去催化活性，表明DXDD執(zhí)行催化功能。對(duì)ApCPS序列分析發(fā)現(xiàn)其DXDD上游具有保守的精氨酸，表明其可能參與到次生代謝而不是初生代謝。
　　3.用RACE技術(shù)從穿心蓮中克隆得

6、到ApPDS，該eDNA全長(zhǎng)2224bp，預(yù)測(cè)有一個(gè)1752bp的完整開(kāi)放閱讀框（序列已登錄GenBank，登錄號(hào)為:KP982892），編碼584個(gè)氨基酸。序列同源性分析表明ApPDS與芝麻、廣藿香、黃芩等其他植物的PDS有很高的同源性，該蛋白包含一個(gè)共有的氨基酸脫氫酶的輔酶結(jié)構(gòu)域NAD(H)-bindingdomain。利用半定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行組織表達(dá)模式分析，結(jié)果表明PDS基因在穿心蓮的根、莖、葉、花中均有表達(dá)，表達(dá)量為葉＞

7、花＞莖＞根。
　　4.用VIGS方法在穿心功蓮體內(nèi)鑒定ApPDS的功能，構(gòu)建VIGS載體pTRV2-PDS，經(jīng)農(nóng)桿菌浸染穿心蓮葉片，植物表型觀察到葉片輕微變黃，qRT-PCR檢測(cè)到ApPDS基因下調(diào)，表明VIGS技術(shù)在穿心蓮植株體內(nèi)被成功運(yùn)用。
　　5.利用VIGS在穿心蓮葉片中沉默ApCPS，使其基因表達(dá)下調(diào)了49.80％，并且ApCPS基因的沉默負(fù)反饋調(diào)節(jié)GGPS的表達(dá)，對(duì)HMGR、DXS的表達(dá)沒(méi)有影響。HPLC法檢測(cè)到