川芎嗪治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的臨床觀察及對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　 1、觀察川芎嗪治療瘀血阻絡(luò)型膝骨性關(guān)節(jié)炎的臨床療效，為川芎嗪應(yīng)用于骨性關(guān)節(jié)炎的防治提供臨床資料。
　　 2、探討川芎嗪對(duì)兔軟骨細(xì)胞增殖與凋亡影響及其作用機(jī)制，從分子生物學(xué)水平闡明川芎嗪保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的部分機(jī)理。
　　 方法：
　　 1、選擇臨床瘀血阻絡(luò)型膝骨性關(guān)節(jié)炎患者76例（102個(gè)膝），用抽簽法隨機(jī)分為治療組38例（52個(gè)膝）與對(duì)照組38例（50個(gè)膝）。治療組于患側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射川芎嗪注射

2、液，每次2ml，每周1次，連續(xù)5周為1個(gè)療程。對(duì)照組于患側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉注射液，每次2ml，每周1次，連續(xù)5周為1個(gè)療程。觀察治療前后患者的臨床療效、關(guān)節(jié)癥狀總積分、關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6、TNF-α、MMP-3含量變化。
　　 2、4周齡雄性新西蘭大白兔16只，取膝關(guān)節(jié)軟骨建立體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞體系，甲苯胺藍(lán)染色鑒定軟骨細(xì)胞，熒光倒置相差顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu);MTT檢測(cè)第2至5代軟骨細(xì)胞的增長(zhǎng)曲線。

3、　　 3、第3代軟骨細(xì)胞同步化，抽簽法隨機(jī)分為對(duì)照組(川芎嗪終濃度0 ug/L的10％FBS DMEM)、中劑量組(川芎嗪終濃度50 ug/L的10％FBS DMEM)，分別培養(yǎng)24h、48h、72h、96h，MTT檢測(cè)軟骨細(xì)胞的活性，確定川芎嗪的有效干預(yù)時(shí)間。第3代軟骨細(xì)胞同步化，抽簽法隨機(jī)分為對(duì)照組(川芎嗪終濃度0 ug/L的10％FBS DMEM)、低劑量組(川芎嗪終濃度25 ug/L的10％FBSDMEM)、中劑量組(川芎嗪終

4、濃度50 ug/L的10％FBS DMEM)、高劑量組(川芎嗪終濃度100 ug/L的10％FBS DMEM)，各組干預(yù)72h后，透射電子顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)軟骨細(xì)胞周期分布，RT-PCR檢測(cè)軟骨細(xì)胞CyclinD1、CDK4、p21mRNA表達(dá)，Western-Blot檢測(cè)軟骨細(xì)胞CyclinD1、CDK4、p21蛋白表達(dá)。
　　 4、第3代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)72h，加入含SNP終濃度為1mmol/L的10％

5、FBS DMEM干預(yù)24h復(fù)制軟骨細(xì)胞凋亡模型，細(xì)胞分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組;并設(shè)正常組，加入10％FBS DMEM，分組進(jìn)行干預(yù)12h、24h、36h，MTT檢測(cè)軟骨細(xì)胞的活性，確定川芎嗪的有效干預(yù)時(shí)間。第3代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)72h，正常組加入10％FBS DMEM，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組加入含SNP終濃度為1mmol/L的10％FBS DMEM干預(yù)24h后，各組再加相應(yīng)藥物干預(yù)24h，MTT法檢測(cè)軟骨細(xì)胞活

6、性，透射電子顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)軟骨細(xì)胞的凋亡，RT-PCR檢測(cè)軟骨細(xì)胞Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)，Western-Blot檢測(cè)軟骨細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)，比色法檢測(cè)軟骨細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9蛋白的活性。
　　 結(jié)果：
　　 1、川芎嗪治療瘀血阻絡(luò)型膝骨性關(guān)節(jié)炎的臨床研究:76例（102個(gè)膝）患者，完成治療73例（99個(gè)膝），其中，治療組剔除1例（1個(gè)膝），對(duì)照組

7、剔除2例（2個(gè)膝）。兩組治療后臨床優(yōu)良率、有效率比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。治療后兩組癥狀積分前后分值差異比較，治療組雖低于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05）。與治療前比較，兩組IL-1、IL-6、TNF-α、MMP-3含量均明顯降低（P＜0.05);治療后兩組降低程度比較，各指標(biāo)雖有差異，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)
　　 2、原代、第2代、第3代軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，甲苯胺藍(lán)染色后，胞漿內(nèi)見(jiàn)紫紅色異染顆粒。增殖曲

8、線上，第2、3代軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，活性比第4、5代軟骨細(xì)胞高，尤其是第3代軟骨細(xì)胞;第3代軟骨細(xì)胞，第3天增殖開(kāi)始加速，第4天進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，第5、6天增殖速度逐漸減慢。
　　 3、川芎嗪促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的研究:
　　 (1)川芎嗪促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的有效作用時(shí)間為72h。中劑量組干預(yù)72h細(xì)胞OD值明顯高于干預(yù)24h、48h、96h（P＜0.05）。
　　 (2)透射電子顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu):干預(yù)72h后

9、各組細(xì)胞呈圓形、橢圓形、多角形，核呈圓形為主，可見(jiàn)分葉狀、不規(guī)則，染色質(zhì)分布均勻，核仁清晰，中劑量組可見(jiàn)胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富擴(kuò)張，高劑量組可見(jiàn)細(xì)胞核的分裂。
　　 (3)軟骨細(xì)胞的周期分布:干預(yù)72h，中劑量組、高劑量組G0/G1期顯著低于對(duì)照組同期（P＜0.01)，G2/M期明顯高于對(duì)照組同期、低劑量組（P＜0.05），PI明顯高于對(duì)照組同期（P＜0.05）。
　　 (4)軟骨細(xì)胞CyclinD1、CDK4 mRNA表

10、達(dá)，干預(yù)72h，中劑量組、高劑量組明顯高于對(duì)照組、低劑量組（P＜0.05）;軟骨細(xì)胞p21 mRNA表達(dá)，干預(yù)72h，中劑量組、高劑量組明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。
　　 (5)軟骨細(xì)胞CyclinD1、CDK4蛋白表達(dá)，干預(yù)72h，中劑量組、高劑量組明顯高于對(duì)照組、低劑量組（P＜0.05）;軟骨細(xì)胞p21蛋白表達(dá)，中劑量組、高劑量組明顯低于對(duì)照組、低劑量組（P＜0.05）。
　　 4、川芎嗪抑制軟骨細(xì)胞凋亡的研究:

11、
　　 (1)川芎嗪抑制軟骨細(xì)胞凋亡的有效作用時(shí)間為24h;干預(yù)24h后，軟骨細(xì)胞OD值，中劑量組、高劑量組明顯高于模型組（P＜0.05)。
　　 (2)透射電子顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu):干預(yù)24h，模型組可見(jiàn)大量碎裂的壞死、凋亡的軟骨細(xì)胞;低劑量組見(jiàn)較多碎裂、凋亡的軟骨細(xì)胞;中劑量組、高劑量組見(jiàn)少量壞死、凋亡的軟骨細(xì)胞。
　　 (3)軟骨細(xì)胞的總凋亡率:模型組(54.30±1.58)％，低劑量組(27.00

12、±3.24)％，中劑量組(19.09±3.33)％，高劑量組(16.22±2.59)％，中劑量組、高劑量組明顯低于模型組、低劑量組(P＜0.05)。
　　 (4)軟骨細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)，中劑量組、高劑量組明顯低于模型組（P＜0.05）;軟骨細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)，中劑量組、高劑量組明顯高于模型組(P＜0.05)。
　　 (5)軟骨細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)，中劑量組、高劑量組明顯低于模型組（P＜0.05）;軟骨細(xì)胞

13、Bc(l)-2蛋白的表達(dá)，中劑量組、高劑量組明顯高于模型組（P＜0.05）。
　　 (6)軟骨細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9蛋白活性，中劑量組、高劑量組顯著低于模型組（P＜0.01)，中劑量組、高劑量明顯低于低劑量組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、川芎嗪關(guān)節(jié)腔注射治療能有效緩解瘀血阻絡(luò)型膝骨性關(guān)節(jié)炎患者的臨床癥狀，降低關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6、TNF-α、MMP-3的含量，是治療膝骨性關(guān)

14、節(jié)炎的有效方法之一。
　　 2、川芎嗪能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。其作用機(jī)制可能通過(guò)上調(diào)軟骨細(xì)胞周期正向調(diào)節(jié)因子CyclinD1、CDK4表達(dá)，下調(diào)負(fù)向調(diào)節(jié)因子p21表達(dá)，加速軟骨細(xì)胞周期關(guān)鍵限制點(diǎn)G1/S期的切換，促進(jìn)軟骨細(xì)胞周期的進(jìn)程。
　　 3、川芎嗪能抑制軟骨細(xì)胞凋亡。其作用機(jī)制可能通過(guò)下調(diào)軟骨細(xì)胞促凋亡因子Bax、Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)，抑制軟骨細(xì)胞線粒體凋亡通路的信