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文檔簡介
1、1. 背景與目的
血管內(nèi)皮損傷和損傷后的不良修復(fù)是冠心病、高血壓、經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention,PCI)后再狹窄等血管損傷性疾病發(fā)病的共同病理生理基礎(chǔ)。如何盡早促進(jìn)血管損傷后的再內(nèi)皮化是防治這類疾病形成的關(guān)鍵策略。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為,內(nèi)皮損傷的修復(fù)主要依靠臨近成熟內(nèi)皮的遷移和增殖,但其增殖能力有限。晚近的研究證實,骨髓和外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞(endotheliAlprog
2、enitor cells,EPCs)能歸巢至損傷血管局部,分化為內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)血管的良性修復(fù)。EPCs的增殖、遷移等生物學(xué)行為是其修復(fù)內(nèi)皮功能的基礎(chǔ),然而,目前調(diào)控EPCs 生物學(xué)行為的機(jī)制,尤其是離子通道方面,仍不清楚。
鈣離子是調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能比如增殖、分化等的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn),鈣離子參與調(diào)控EPCs的增殖、歸巢及分化功能。鈣離子對細(xì)胞功能的影響通過胞膜鈣通道調(diào)控的鈣內(nèi)流來實現(xiàn),在EPCs 這種非興奮性細(xì)胞,由于
3、缺乏電壓依賴性鈣通道,主要以鈣庫操縱性鈣通道為主(store-operated calcium channals,SOCs), SOCs 由基質(zhì)交聯(lián)分子1(stromAlinteracting molecule 1,STIM1)、Orai和瞬時受體電位通道(transientreceptor potentiAlcanonical,TRPC)家族構(gòu)成。STIM1在SOCs中發(fā)揮感受器作用,STIM1感受胞內(nèi)鈣庫耗竭,激活Orai和TRPC
4、通道,介導(dǎo)鈣庫操縱性鈣內(nèi)流(store-operatedcalcium entry,SOCE),以補充胞內(nèi)鈣。
晚近的研究發(fā)現(xiàn),基因沉默STIM1可通過抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖而抑制血管損傷后新生內(nèi)膜的形成。TRPC1抗體也可抑制隱靜脈平滑肌細(xì)胞增殖導(dǎo)致的新生內(nèi)膜肥厚。而EPCs作為血管損傷修復(fù)中的一重要細(xì)胞來源,STIM1及TRPC1是否也通過影響EPCs的功能而參與血管損傷修復(fù)過程的調(diào)節(jié),目前仍不清楚。我們的前期研究發(fā)
5、現(xiàn),EPCs上有STIM1和TRPC1分子的表達(dá)。因此,我們提出假設(shè),STIM1和TRPC1可能參與EPCs 增殖、遷移等生物理學(xué)形為的調(diào)節(jié),從而影響其修復(fù)損傷血管的能力。
2.方法
2.1STIM1對EPCs 修復(fù)損傷血管能力的影響2.1.1STIM1對EPCs 增殖、遷移的作用2.1.1.1大鼠骨髓源EPCs的分離培養(yǎng)和鑒定用密度梯度離心法分離大鼠骨髓源的單個核細(xì)胞,用含20%FBS的DMEM-L 培養(yǎng)基
6、培養(yǎng)。在普通顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征,熒光雙染實驗鑒定對DiI-Ac-LDL-和UEA-1均染色陽性的細(xì)胞為正在分化的EPCs。用流式細(xì)胞術(shù)鑒定EPCs表面分子CD34、CD45、CD133、及VEGFR2的表達(dá)。
2.1.1.2 STIM1對EPCs 增殖、遷移的作用分離培養(yǎng)5-7天的大鼠骨髓源EPCs 用于實驗。將STIM1干擾腺病毒質(zhì)粒(Ad-si/rSTIM1)、人源STIM1表達(dá)質(zhì)粒(Ad-hSTIM1)及對
7、應(yīng)的非沉默作用的對照腺病毒(NSC)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48小時后用于實驗。采用細(xì)胞計數(shù)法和3H-TdR 摻入法檢測EPCs的增殖情況,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況,較正的boyden小室檢測細(xì)胞的遷移能力。
2.1.2 觀察STIM1對EPCs 修復(fù)損傷血管能力的影響復(fù)制大鼠頸動脈球囊損傷模型,用2%戊巴比妥鈉麻醉后,以頸前正中線為切口,暴露左頸總動脈分叉,分離頸外動脈,分別在頸外動脈近、遠(yuǎn)兩側(cè)套線,結(jié)扎其遠(yuǎn)側(cè)。
8、 用動脈夾暫時阻斷頸內(nèi)和頸總動脈血流,在頸外動脈結(jié)扎近側(cè)穿刺,繼之將2FForgarty 導(dǎo)管沿小口送入頸總動脈大約1-2cm,以1.5 atm-2 atm 充盈球囊,阻斷血流約30秒,然后緩慢來回抽動球囊,反復(fù)3次,退出導(dǎo)管,結(jié)扎頸外動脈,常規(guī)縫合傷口。術(shù)后立即經(jīng)尾靜脈注入事先轉(zhuǎn)染Ad-si/rSTIM1、Ad-hSTIM1和NSC 并且經(jīng)Dil-LDL 標(biāo)記的EPCs(1×106)。術(shù)后用青霉素預(yù)防感染。伊文氏藍(lán)染色觀察損傷后7天
9、、14天血管再內(nèi)皮化。HE 染色觀察損傷后14天新生內(nèi)膜的增生情況。
2.2 觀察STIM1與TRPC1相互作用調(diào)控EPCs的鈣庫操縱性鈣內(nèi)流免疫熒光檢測TRPC1在EPCs的定位,免疫共沉淀檢測STIM1與TRPC1在EPCs的相互作用。RT-PCR和Western blot 檢測TRPC1的表達(dá),ELISA 方法檢測STIM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后上清中IP3蛋白的表達(dá)情況。激光共聚焦檢測EPCs內(nèi)鈣變化情況。
2.
10、3 TRPC1對EPCs的增殖和遷移的影響及其機(jī)制探討分離培養(yǎng)5-7天的大鼠骨髓源EPCs 用于實驗。將TRPC1的小RNA 干擾質(zhì)粒(siRNA-TRPC1)及對應(yīng)的非沉默作用的siRNA對照質(zhì)粒(siRNA-control)、TRPC1的發(fā)夾狀RNA 干擾質(zhì)粒(shRNA-TRPC1)及對應(yīng)的非沉默作用的shRNA對照質(zhì)粒(shRNA-control)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48~72小時后用于實驗。采用細(xì)胞計數(shù)法和3H-TdR摻入法檢測EP
11、Cs的增殖情況,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期,較正的boyden小室檢測細(xì)胞的遷移能力,激光共聚焦檢測EPCs內(nèi)鈣變化情況。用細(xì)胞周期基因芯片篩選TRPC1干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EPCs 48小時后細(xì)胞周期基因的變化情況,篩選TRPC1作用的下游靶點。
選擇芯片中變化最大的基因激活和或阻斷其功能,觀察在沉默TRPC1的基礎(chǔ)上EPCs的增殖和細(xì)胞周期的變化,探討TRPC1的下游靶點。
3.結(jié)論
本研究主要結(jié)論:<
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