心臟成纖維細(xì)胞中NLRP3炎癥小體對(duì)新生乳鼠心肌細(xì)胞體外增殖能力的影響及機(jī)制研究.pdf

1、心肌病、冠心病、風(fēng)濕性心臟病等心臟疾病的主要病理特征為功能性心肌細(xì)胞數(shù)量缺失。對(duì)于心臟再生增殖和心肌損傷修復(fù)的研究、哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法和再生增殖特征的研究，以及炎性條件下心肌中炎癥小體的產(chǎn)生，尤其是NLRP3炎癥小體對(duì)心肌細(xì)胞增殖修復(fù)的影響為當(dāng)前關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　本研究采用新生C57 BL/6乳鼠心臟細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞體外原代共培養(yǎng)方法，研究不同日齡乳鼠心肌細(xì)胞的體外增殖特征，并通過(guò)構(gòu)建體外炎癥模型觀察NLRP3炎癥

2、小體對(duì)心肌細(xì)胞體外增殖的影響。該課題研究在進(jìn)化、發(fā)展和再生生物學(xué)領(lǐng)域具有深遠(yuǎn)的意義，同時(shí)對(duì)嬰幼兒心臟疾病以及由炎癥引起的青少年心肌炎患者的治療具有重要的指導(dǎo)作用。文中從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　一、新生乳鼠心臟細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系的建立及其在心肌細(xì)胞體外增殖研究中的應(yīng)用
　　目的:建立新生C57 BL/6乳鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞體外原代培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系，研究不同日齡的新生C57 BL/6乳鼠心肌細(xì)胞的體外增殖特征。

3、　　方法:(1)采用混合酶消化法（0.08％胰蛋白酶和0.1％Ⅱ型膠原酶組成的混合酶消化液）消化不同日齡（出生1，3，5，7，9天）提取的新生C57 BL/6乳鼠心臟細(xì)胞，通過(guò)差速貼壁法和化學(xué)抑制劑法分離和純化心肌細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞存活率。(2)分別對(duì)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外原代培養(yǎng)和上述二種細(xì)胞的共培養(yǎng)。(3)用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化;分別用α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-sarcomeric actin，α-SA)

4、抗體和波形蛋白(Vimentin)抗體對(duì)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，以鑒定細(xì)胞的純度。通過(guò)記錄心肌細(xì)胞每分鐘的搏動(dòng)次數(shù)測(cè)定心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力。(4) MTT法測(cè)定單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)條件下心肌細(xì)胞的增殖活性。(5)檢測(cè)各組細(xì)胞中細(xì)胞周期調(diào)控因子CyelinD1和CDK4、心臟分化相關(guān)因子GATA4、Nkx2.5以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1)混合消化酶提取的細(xì)胞數(shù)量多，存活率高;培養(yǎng)1h后成纖

5、維細(xì)胞先貼壁，12h后心肌細(xì)胞幾乎全部貼壁。(2)心肌細(xì)胞中α-橫紋肌動(dòng)蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，純度可達(dá)93％，成纖維細(xì)胞中波形蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，純度可達(dá)95％。(3)共培養(yǎng)24 h后，心肌細(xì)胞多以細(xì)胞團(tuán)的形式貼壁生長(zhǎng)，可見部分細(xì)胞團(tuán)的自發(fā)搏動(dòng);單獨(dú)培養(yǎng)24 h后，心肌細(xì)胞貼壁呈梭形;共培養(yǎng)的心肌細(xì)胞比單獨(dú)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞交聯(lián)速度快，達(dá)到搏動(dòng)同步的時(shí)間早。(4)出生5天以內(nèi)的乳鼠心肌細(xì)胞數(shù)量和體積明顯增大，共培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力更大、增殖速度快

6、;出生5天以后的乳鼠心肌細(xì)胞數(shù)量變化并不明顯。(5)出生5天以內(nèi)的乳鼠心肌細(xì)胞中CyclinD1和CDK4的表達(dá)量較高，且共培養(yǎng)的心肌細(xì)胞表達(dá)量要高于單獨(dú)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞表達(dá)量;GATA4、Nkx2.5和FGF1的表達(dá)隨日齡增大而增加。
　　結(jié)論:(1)差速貼壁法和化學(xué)抑制劑法能夠有效地分離心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，得到純度高、活力好的心肌細(xì)胞。(2)不同日齡的心肌細(xì)胞在共培養(yǎng)環(huán)境下生長(zhǎng)狀態(tài)良好。(3)出生5天內(nèi)的心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)具有

7、較強(qiáng)的增殖能力，且成纖維細(xì)胞能促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖;出生5天以后的乳鼠心肌細(xì)胞的增殖能力減弱甚至消失。(4)建立新生乳鼠心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞體外原代培養(yǎng)和共培養(yǎng)方法可用于后續(xù)的研究觀察。
　　二、NLRP3炎癥小體激活后對(duì)心肌細(xì)胞體外增殖的影響研究
　　目的:研究成纖維細(xì)胞中的NLRP3炎癥小體激活后對(duì)新生C57BL/6乳鼠心肌細(xì)胞體外增殖能力的影響。
　　方法:(1)采用雙酶消化法分別提取日齡為1天的野生型和Nlrp3-

8、/-基因敲除C57BL/6小鼠乳鼠心臟細(xì)胞，通過(guò)差速貼壁法和化學(xué)抑制劑法分離和純化心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。(2)將細(xì)胞按如下分組接種到細(xì)胞培養(yǎng)板:野生型成纖維細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，野生型成纖維細(xì)胞與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，Nlrp3-/-成纖維細(xì)胞與野生型心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，Nlrp3-/-心肌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)。各組細(xì)胞在體外正常培養(yǎng)24h后，分別加入10ng/mL的LPS，作用24 h，再加入3mM的ATP刺激1h，同時(shí)設(shè)立正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的對(duì)照組。(3)用倒置

9、相差顯微鏡觀察各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況;MTT法測(cè)定細(xì)胞的增殖活性;收集培養(yǎng)板中各組細(xì)胞，用蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)）即Western Blot方法檢測(cè)炎癥因子NLRP3、ASC、Caspase-1，細(xì)胞周期調(diào)控因子CDK4、Cyclin D1，心肌細(xì)胞增殖分化相關(guān)因子Nkx2.5、GATA4蛋白的表達(dá)情況;用real time PCR(熒光定量PCR)檢測(cè)相應(yīng)基因的mRNA表達(dá)水平;ELISA方法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的

10、IL-1β含量;對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:(1)與對(duì)照組相比，經(jīng)LPS/ATP刺激的實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞活性有所降低，數(shù)量略有減少。共培養(yǎng)的心肌細(xì)胞受到損傷且細(xì)胞數(shù)量明顯減少;野生型心肌細(xì)胞受損程度大于Nlrp3-/-心肌細(xì)胞。(2) Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)顯著增加、CDK4、Cyclin D1、Nkx2.5、GATA4表達(dá)降低;real