小鼠胚胎成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌細(xì)胞的探討.pdf

1、目的：
　　將終末分化的成纖維細(xì)胞直接定向誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞，為心肌細(xì)胞再生提供一種新思路。
　　方法：
　　首先構(gòu)建慢病毒載體，載體成功構(gòu)建后使用慢病毒將Gata4、Tbx5及Mef-2c三種轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染至小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中,以及添加促進(jìn)干細(xì)胞分化的小分子物質(zhì)丙戊酸鈉（VPA）與維生素C（VitC），轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)21天，采用免疫熒光染色、RT-PCR、Western Blot等方法對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞從基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水

2、平，檢測(cè)其定向分化為心肌細(xì)胞的效率。
　　結(jié)果：
　　細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后7天、14天、21天均未見心肌特異性蛋白cardiac-TroponinT、α-MHC及α-actnin的表達(dá)。添加小分子物質(zhì)VPA、VitC后培養(yǎng)7天、14天、21天后的細(xì)胞也無出現(xiàn)心肌特異性蛋白cardiac-TroponinT、α-MHC及α-actnin的表達(dá)，更未出現(xiàn)自發(fā)跳動(dòng)的細(xì)胞。我們采用RT-PCR來檢測(cè)心肌標(biāo)志基因的表達(dá)情況。檢測(cè)

3、結(jié)果顯示心肌標(biāo)志基因TNNI3（cTnI）、Actn2(α-actinin)表達(dá)方面：?jiǎn)斡肎ata4、Mef-2c及Tbx-5組，以及Gata4、Mef-2c及Tbx-5三種轉(zhuǎn)染因子共同作用的GMT組，TNNI3、Actn2的表達(dá)雖然比成纖維細(xì)胞陰性對(duì)照組略微增高，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及小鼠心肌細(xì)胞陽性對(duì)照組。添加小分子物質(zhì)VPA、VitC組別與GMT組相比，TNNI3、Actn2基因表達(dá)無明顯升高，作用不明顯。通過 Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)

4、果表明，檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌細(xì)胞，以及添加小分子物質(zhì)VPA、VitC增加轉(zhuǎn)染效率后，均沒有特異性心肌蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)提示，從轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)水平、蛋白表達(dá)水平都證實(shí)，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在Gata4、Mef-2c、Tbx5這三種轉(zhuǎn)錄因子作用下定向向心肌細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究方面，效率低下。在我們添加能促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化的小分子物質(zhì)VPA以及VitC之后，也未能使其效率有所提高。在探討心肌細(xì)