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文檔簡介
1、目的:隨著組織工程技術的快速發(fā)展,組織工程骨的出現(xiàn)為大段骨缺損修復帶來新的希望。然而,血管化問題仍是制約組織工程骨應用于臨床的關鍵因素。支架材料作為骨組織工程的三大要素之一,對組織工程骨體內快速血管化和新骨形成起著重要作用。因此,本研究擬制備新型促血管化支架材料并評價其體內外生物學性能。
方法:(1)新型促血管化支架材料制備及表征:①首先以可溶性鈣鹽、銅鹽、鋅鹽、磷鹽為原料,采用化學沉淀法制備缺鈣磷灰石粉體。將粉體制成漿料,以
2、海藻酸鈣為造孔劑,經高溫煅燒,得到摻雜銅/鋅離子的雙相磷酸鈣多孔支架。根據(jù)離子摻雜含量不同(Cu/(Cu+Zn+Ca)摩爾比分別為0,0.005,0.02,0.05,Cu/Zn摩爾比1∶1),將得到產物分別定義為P0、P1、P2和P3。采用掃描電鏡(SEM)、X射線衍射儀(XRD)、紅外光譜儀(FTIR)、X射線光電子能譜分析儀(XPS)對支架形貌、晶相組成及化學成分進行表征,萬能力學試驗機測定其強度,電感耦合等離子光譜發(fā)生儀(ICP)
3、檢測鈣、銅、鋅離子釋放情況。②通過乳化法合成載GDF-5蛋白的PLGA微球,真空負壓法將微球與支架(P2)復合,獲得載GDF-5的多孔支架(定義為P2/GDF-5)。采用SEM對微球形貌及其在支架上的分布進行觀察;采用BCA蛋白測定法測定GDF-5的釋放曲線。(2)新型促血管化支架材料體外生物學性能評價:①將骨髓間充質干細胞(BMSC)和內皮細胞(EC)1∶1混合后與支架共培養(yǎng),SEM和細胞核熒光染色(DAPI)觀察細胞在支架上生長情況
4、,CCK-8法檢測細胞增殖,堿性磷酸酶(ALP)試劑盒檢測ALP活性,熒光定量PCR檢測細胞成骨相關基因表達水平,ELISA法檢測VEGF分泌水平;②制備材料浸提液,分別添加等濃度Cu2+、Zn2+的培養(yǎng)基為對照組,并與細胞共培養(yǎng)。采用上述方法檢測細胞增殖和ALP活性;茜素紅染色觀察BMSC成骨和礦化;Matrigel測定EC成血管能力。(3)新型促血管化支架材料體內生物學性能評價:首先構建兔橈骨15mm缺損模型,實驗分為五組:K組:不
5、植入任何材料;D組:植入P0;S1組:植入P1;S2組:植入P2;S3組:植入P2/GDF-5。術后4、8、12周行X線影像學檢查,術后12周處死后,標本包埋、切片后行HE、Masson染色。
結果:(1)新型促血管化支架材料表征:①SEM顯示:支架孔徑約600~800μm,孔隙貫通,且隨著金屬離子含量的增加,支架表面由平滑、點狀顆粒、塊狀顆粒逐漸變化。XRD、FTIR和X射XPS分析顯示:P0、P1和P2主要由HA和β-TC
6、P組成,其中P2組HA/TCP為30/70,而P3主要為β-TCP??箟簭姸葴y試表明:隨著離子濃度由0%增加到5%,支架抗壓強度由1.51MPa小幅度降至0.91MPa。離子體外釋放顯示,銅、鋅離子釋放量隨添加量的增加而增加,同時鈣離子釋放速度也隨之加快。②SEM見GDF-5/PLGA微球呈球形,表面光滑,粒徑主要分布在8-20μm之間;微球均勻分布在支架的孔壁上,無明顯團聚。體外釋放示:單純微球和微球在支架材料上,兩者GDF-5釋放曲
7、線相似,均實現(xiàn)平穩(wěn)釋放。(2)新型促血管化支架材料體外生物學性能評價:①支架材料均無明顯的細胞毒性,細胞能較好地粘附、生長,P2/GDF-5支架上的細胞最多,P2次之;CCK-8檢測也顯示:各組細胞增值良好,且P2/GDF-5組細胞增值明顯優(yōu)于其余三組(P<0.01)。ALP檢測表明第14天時,P2/GDF-5組ALP表達水平最高,P2組次之。PCR分析顯示P2/GDF-5組細胞的ALP、OCN、OPN基因表達水平較其他各組明顯上調(P
8、<0.05);P2組細胞ALP、OCN、OSX表達水平較P0組高(P<0.001)。VEGF分泌量檢測示:各組間均有差異(P<0.05),且P2/GDF-5組分泌水平最高。②浸提液結果表明:浸提液組中細胞增殖速度最快,且Zn2+組及浸提液組ALP活性明顯高于Cu2+組和空白組(P<0.01);Matrigel成血管測試顯示:Cu2+組和浸提液組內皮細胞12h內形成管腔樣結構,而Zn2+組和空白組細胞呈簇狀分布,未見管腔樣結構形成;培養(yǎng)2
9、1天后茜素紅染色顯示,Zn2+組和浸提液組鈣結節(jié)的數(shù)量和面積明顯多于空白組和銅離子組。(3)新型促血管化支架材料體外生物學性能評價:術后動物無死亡,所有動物術后能正常進食及活動。術后4周,X線影像學顯示:所有組支架材料清晰可見,無脫落、移位,骨缺損間隙明顯,僅S3組兩端可見少量低密度骨痂與材料連接;術后8周,支架材料部分降解,且S1、S2和S3組材料降解量大于D組,K組和D組中新生硬化骨封閉髓腔口,斷端間暫無明顯骨性連接,S1、S2和S
10、3均可見斷端部分骨性連接,骨性連接面積:S3>S2>S1;術后12周,K組斷端仍封閉,D組靠近尺骨側可見少量骨性連接,S1、S2、S3組骨缺損基本愈合,骨皮質連續(xù),部分髓腔實現(xiàn)貫通,S3修復速率明顯優(yōu)于其余各組。Lane-Sandhu X線評分結果表明,各時間點S3組評分最高,S2次之,各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。組織學檢測表明所有支架植入部位均未出現(xiàn)明顯炎癥、毒性和免疫排斥反應。術后12周HE及Masson染色顯示S1、S
11、2、S3組均可見大量新生骨形成,S3組髓腔塑性較好,且新生血管數(shù)量明顯多于S1和S2組,D組可見部分類骨樣組織沿孔壁生長,K組缺損部位為大量纖維樣組織;定量統(tǒng)計分析顯示:S3組新生骨面積和血管數(shù)量多于各組(P<0.01)。
結論:以海藻酸鈣為造孔劑,以PLGA微球為載體,成功制備了具有GDF-5緩釋功能的銅/鋅離子共摻雜雙相磷酸鈣多孔支架。該支架具有良好的細胞相容性、成骨誘導性和促血管化,且能快速修復大段骨缺損,是一種具有良好
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