真養(yǎng)產(chǎn)堿菌中二個(gè)與聚β-羥基丁酸生物合成有關(guān)的基因的克隆.pdf

1、摘要飛真氧產(chǎn)。。H16M(AlcaligeneseutrophusH16)中康。。基丁酸，HB)的合成過(guò)程是:乙酞CoA經(jīng)3酮配酞CoA硫解酶的催化生成乙酞乙酞CoA乙酞乙酞CoA經(jīng)乙酞轉(zhuǎn)移酶的催化生成3輕基丁酞CoA3輕基丁酞CoA再經(jīng)PHB合成酶的催化生成產(chǎn)物聚0基丁酸(PHB).對(duì)應(yīng)于這三種酶的三個(gè)基因分別為:①phbA3N4酷酞CoA硫解酶②phbB乙酞轉(zhuǎn)移酶@sphbCPHB合成酶。這三個(gè)基因構(gòu)成一個(gè)操縱元，由一個(gè)啟動(dòng)子負(fù)責(zé)其

2、轉(zhuǎn)錄。這段包括啟動(dòng)子在內(nèi)的三個(gè)酶的基因的DNA序列長(zhǎng)約4.2kb.卜一活一、一本工作可分為兩個(gè)部分。第一部分是通過(guò)資料找到此4.2kb片段的DNA序列，利用Primer4和VectNTI軟件對(duì)其內(nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行分析，并分段設(shè)計(jì)引物。用PCR分段克隆的辦法得到phbA和phbB兩基因，并將二者連接到T質(zhì)粒上轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中。第二部分是用PCR擴(kuò)增出分別位于4.2kb片段頭和尾的兩段約1.Okb的DNA片段作為探針，用32P標(biāo)記后與經(jīng)

3、EcoRIBamHI酶切的染色體DNA片段進(jìn)行Southem雜交，兩探針雜交結(jié)果相同，都在同一位置出現(xiàn)唯一的雜交信號(hào)，因此，找到了一個(gè)約lOkb的EcoRIBamHI區(qū)段，此區(qū)段包含完整的4.2kb片段。關(guān)鍵詞:聚日文庫(kù)丫一輕基丁酸(P斌hbAphbBphbC克彥PC公’目的基因Southem雜彭原位雜交丫大腸桿菌vhybridizationsignaloccurredonlyatlOkbrespectivelyinbothsugges