聚β-羥基丁酸酯與四氫嘧啶共合成技術研究.pdf

1、聚β-羥基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate，PHB)具有良好的材料學性質和生物可降解性，在工業(yè)包裝、農(nóng)用地膜覆蓋等領域具有廣泛的應用前景，市場需求量巨大。四氫嘧啶(1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸;1，4，5，6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid; Ectoine)是某些微生物應答高滲透壓脅迫所合成的一種滲透壓補償性溶質，在細胞保護劑、生物制劑

2、穩(wěn)定劑、化妝品、藥物制劑等領域具有重要的應用價值，商業(yè)附加值高。目前，PHB和Ectoine的商業(yè)化生產(chǎn)和應用規(guī)模均受制于它們的生產(chǎn)效率和成本價格。在提高PHB和Ectoine合成效率的諸多研究中，利用中度嗜鹽菌進行的PHB和Ectoine在一個發(fā)酵過程中同時合成（PHB/Ect共合成）技術，通過Ectoine生產(chǎn)的高附加值對PHB的生產(chǎn)進行經(jīng)濟平衡，在推動PHB的商業(yè)化生產(chǎn)和應用中，顯示了獨特的技術策略和方法，成為該領域的新的研究熱點

3、。截至目前，PHB/Ect共合成的研究還僅限于菌株篩選、工藝條件等方面，某些技術問題如培養(yǎng)基高濃度NaCl、目標產(chǎn)物合成效率低下和提取純化工藝繁復等問題，仍沒有有效的解決思路和方法。
　　本文通過實驗與分析揭示了進一步提高PHB/Ect共合成效率的主要限制因素為:與Eetoine濃度閾值對應的高濃度NaCl對PHB合成的抑制作用;Ectoine與PHB合成不同步，PHB誘導合成階段Ectoine停止合成或部分降解;現(xiàn)有的PHB提取

4、純化過程會造成Ectoine結構破壞。本文提出將Ectoine分泌型菌株用于PHB/Ect共合成可能具備如下優(yōu)勢:在較低NaCl濃度下進行PHB/Ect共合成;實現(xiàn)PHB與Ectoine同步合成;分泌至細胞外的Ectoine，避免平衡期在細胞內(nèi)的降解。利用Ectoine分泌型菌株有望解決PHB/Ect共合成中存在的技術障礙。據(jù)此，本文主要研究內(nèi)容及成果如下:
　　(1)利用Ectoine分泌型菌株進行PHB/Ect共合成研究。從大

5、連旅順鹽場鹽池底泥篩選的2株和本研究室保存的2株Ectoine分泌型菌株中，篩選PHB合成菌株，從中挑選PHB和Ectoine二者合成量最高的菌株Halomonas salina DSM5928。核磁共振分析鑒定H.salina DSM5928在本文實驗條件下細胞內(nèi)合成并積累PHB，合成的Ectoine部分分泌至細胞外。H.salina DSM5928為首次用于PHB/Ect共合成的Ectoine分泌型菌株。這類菌株為解決培養(yǎng)基高濃度N

6、aCl、目標產(chǎn)物合成效率低下和提取純化工藝繁復等問題提供了基礎。
　　(2)優(yōu)化H.salina DSM5928 PHB/Ect共合成條件?？疾镹aCl濃度、初始碳氮比、初始磷酸鹽濃度對PHB/Ect共合成的影響。優(yōu)化的PHB/Ect共合成條件為30 g/L NaCl、初始碳氮比為15、初始磷酸鹽濃度為12 g/L。優(yōu)化條件下PHB/Ect共合成，PHB與Ectoine合成量分別為8.1 g/L和1.3 g/L。30 g/L的最適

7、NaCl濃度顯著顯著低于截至目前報道的PHB/Ect共合成的鹽濃度(≥75 g/L)。
　　(3)在整合PHB和Ectoine合成途徑、分析二者代謝調(diào)控異同點的基礎上，進行H.salina DSM5928 PHB/Ect共合成代謝調(diào)控研究。通過監(jiān)測添加檸檬酸鈉前后乙酸生成量和發(fā)酵液pH確認了PHB/Ect共合成中的碳溢流現(xiàn)象，添加4g/L檸檬酸鈉有效地抑制碳溢流，PHB和Ectoine合成量分別提高65.4％和23.1％;細胞生長

8、平衡期通過限制供氧降低三羧酸循環(huán)流量而一定程度地積累PHB合成前體乙酰輔酶A，使PHB合成量提高了30.9％;葡萄糖和谷氨酸單鈉為混合碳源，強化Ectoine合成代謝流量，使Ectoine合成量提高了1.3倍。研究表明，檸檬酸鈉抑制碳溢流、降低三羧酸循環(huán)流量和葡萄糖與谷氨酸單鈉為混合碳源的綜合代謝調(diào)控手段，能夠顯著提高PHB/Ect共合成效率。
　　(4)進行PHB/Ect共合成發(fā)酵的2.5 L發(fā)酵罐實驗，并建立分批發(fā)酵細胞生長動

9、力學模型和產(chǎn)物生成動力學模型。在動力學模型分析的基礎上進行PHB/Ect共合成補料發(fā)酵。建立的生長動力學模型為dX/dt=0.3×（1-X/21.8）X;建立的產(chǎn)物生成動力學模型為dP/dt=0.2×dX/dt+0.05X。構建的30 g/L NaCl下生長細胞和非生長細胞兩階段PHB/Ect共合成補料分批發(fā)酵，PHB合成量為45.9 g/L，Ectoine合成量為11.2 g/L。PHB/Ect共合成達到截至目前文獻報道的最高水平。其

10、中68.8％的Ectoine在生長平衡期合成，基本實現(xiàn)了PHB和Ectoine同步高效共合成。Ectoine總合成量的80.4％分泌至培養(yǎng)基中，有效地避免了生長平衡期Ectoine的降解。
　　(5)研究了基于低滲透壓沖擊的純水相的、無提取助劑的PHB提取純化方法。考查低滲沖擊強度、提取溫度和提取時間對PHB提取率的影響。60 g/L NaCl的滲透壓差、60℃，提取時間4h，PHB提取率87.5％（純度≥90％）。Ectoine

11、提取率84.2％（純度≥90％）。建立了工藝簡單、安全環(huán)保和低成本高效率的PHB/Ect共合成產(chǎn)物提取技術。
　　本文利用Ectoine分泌型菌株H.salina DSM5928進行的PHB/Ect共合成研究，解決了現(xiàn)有PHB/Ect共合成技術培養(yǎng)基高濃度NaCl、目標產(chǎn)物合成效率低下和提取純化工藝繁復等問題;為進一步提高PHB/Ect共合成效率提出了新的、有效的技術策略和方法。對于推動PHB和Ectoine的商業(yè)化生產(chǎn)和應用、降