碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白對(duì)L02細(xì)胞糖脂代謝的作用.pdf

1、研究背景與目的：
　　 隨著我國經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展和人民生活水平的提高,肥胖和胰島素抵抗在人群中的發(fā)生頻率越來越高,由此導(dǎo)致的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)在人群中也呈逐年上升趨勢,嚴(yán)重威脅國民的健康水平和生活質(zhì)量。脂肪肝和糖尿病是最常見的伴發(fā)疾病之一,在高血糖的情況下,脂肪肝的發(fā)生率明顯增加,但目前關(guān)于高糖狀態(tài)下肝脂質(zhì)代謝異常的機(jī)制并不十分清楚,深入探討其機(jī)制,制

2、定有效的預(yù)防和治療措施顯得極為重要。2001年,Yamashita等[1]發(fā)現(xiàn)了一種與LPK基因啟動(dòng)子上ChoRE序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,命名為碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(carbohydrate response elementbinding protein,ChREBP)。ChREBP是堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸鋅指(basic helix-loop-helix/leucinezipper,bHLH-ZIP)蛋白[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn),

3、葡萄糖代謝產(chǎn)物通過ChREBP以獨(dú)立于胰島素信號(hào)途徑的方式來調(diào)節(jié)糖酵解和脂肪合成相關(guān)酶的基因表達(dá),影響肝臟的脂肪沉積。本實(shí)驗(yàn)利用高濃度葡萄糖體外培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞株(LO2細(xì)胞),觀察肝細(xì)胞的脂肪沉積、ChREBP轉(zhuǎn)位以及LPK、FAS、LXRα、SREBP-lc表達(dá)的變化,首次從正常人肝細(xì)胞水平探討高糖對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響及可能機(jī)制,為進(jìn)一步尋找新的治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、人正常肝細(xì)胞株LO2細(xì)胞用

4、含10％胎牛盎清的1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)、傳代。
　　 2、根據(jù)文獻(xiàn)研究[11],實(shí)驗(yàn)設(shè)立G1組(對(duì)照組,培養(yǎng)基中所含葡莓糖濃度為11mmol/L),G2組(葡萄糖濃度為18mmol/L)和(33組(葡萄糖濃度為25mmol/L)。
　　 3、TG含量測定及油紅O染色了解LO2細(xì)胞脂肪變程度;細(xì)胞免疫熒光觀察ChREBP的核轉(zhuǎn)位情況,RT-PCR方法檢測肝型丙酮酸激酶(liver-pyruvate kinase,LPK)

5、和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-lc(sterolregulatory dement binding protein-lc,SREBP-lc)的mRNA表達(dá),Western blot方法檢測脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)和肝x受體α(Liver X receptor alpha,LXRα)的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功建立高糖誘導(dǎo)LO2肝細(xì)胞脂肪變的細(xì)胞模型。隨著培養(yǎng)基葡萄糖濃度增加及

6、造模時(shí)間延長,肝細(xì)胞脂肪變程度加重。
　　 1)TG含量測定:高糖培養(yǎng)24小時(shí),G2、G3組肝細(xì)胞內(nèi)的TG水平較對(duì)照組G1稍升高(1.51±0.52、1.91±0.53 vs1.28±0.44),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.3573);高糖培養(yǎng)48小時(shí), G2、G3組肝細(xì)胞內(nèi)TG水平明顯升高(3.18±0,25、6.62±0.95 vs1.32±0.28),與G1組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0010和P=0.0008),提示

7、隨著葡萄糖濃度增加及作用時(shí)間的延長,細(xì)胞內(nèi)TG含量增加。
　　 2)油紅O染色顯示:G1組僅見少量橘紅色脂滴;G2、G3組肝細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴較G1組細(xì)胞增多,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長,脂滴增加更明顯。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)TG含量測定及油紅O染色,G3組較G2組細(xì)胞脂變更明顯,故我們選擇葡萄糖濃度25mmol/l為高糖組觀察濃度,進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)。
　　 2、各組細(xì)胞內(nèi)ChREBP的核轉(zhuǎn)位情況
　　 高糖刺激3小時(shí)ChREBP表達(dá)逐漸由

8、胞漿轉(zhuǎn)位至胞核,6-12小時(shí)達(dá)到高峰,轉(zhuǎn)位率約20%左右,24小時(shí)開始減少。對(duì)照組ChREBP主要表達(dá)在胞漿。
　　 3、兩組細(xì)胞內(nèi)LPK、SREBP-1c mRNA表達(dá)的變化
　　 與對(duì)照組比較,高糖組細(xì)胞隨著葡萄糖的刺激,LPK mRNA表達(dá)量增加,6h、12h、24h和36h分別為0.375±0.029 vs0.215±0.045(P=0.0066)、0.527±0.016 vs0.215±0.045(P=0.00

9、03)、0.413±0.064 vs0.215±0.045(P=0.0118)和0.306±0.025 vs0.215±0.045(p=0.0376),各時(shí)間點(diǎn)LPK mRNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,LPKmRNA表達(dá)量于12小時(shí)達(dá)高峰,后逐漸降低;高糖組各時(shí)間點(diǎn)SREBP-1c mRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4、各組細(xì)胞內(nèi)FAS、LXRα蛋自表達(dá)的變化
　　 與對(duì)照組比較,高糖

10、組細(xì)胞24h、48h的FAS蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴增加,分別為0.375±0.025 vs0.258±0.019(P=0.0030)和0.524±0.021 vs0.258±0.019(P=0.0001).差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;然而高糖組細(xì)胞24h、48h LXRα蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較無明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、葡萄糖可能通過其代謝產(chǎn)物經(jīng)ChREBP-LPK-FAS途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪