甜菜亞硝酸還原酶基因克隆及生物信息學(xué)分析.pdf

1、甜菜是我國(guó)北方特有的糖料作物,在我國(guó)北方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。目前黑龍江省乃至全國(guó)甜菜單產(chǎn)不高、總產(chǎn)不穩(wěn),特別是含糖率呈下降趨勢(shì),已成為限制我國(guó)甜菜糖業(yè)發(fā)展的障礙性因子。氮素供應(yīng)不合理是主要原因之一。亞硝酸還原酶(NiR)是植物硝態(tài)氮同化過程中一個(gè)十分重要的酶,其與硝酸還原酶(NR)偶聯(lián)完成NO3-的無機(jī)同化。目前,與NR相比較,有關(guān)NiR研究尚少。本研究以二倍體栽培甜菜甜研7號(hào)為試驗(yàn)材料,運(yùn)用簡(jiǎn)并PCR和5'/3'-RACE法首次分

2、離了甜菜的亞硝酸還原酶基因。在此基礎(chǔ)上,利用生物信息學(xué)手段對(duì)甜菜NiRcDNA推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行主要結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測(cè),旨在從酶分子的結(jié)構(gòu)上揭示甜菜亞硝酸還原酶的調(diào)控機(jī)理。研究結(jié)果如下:
　　 1利用簡(jiǎn)并PCR和5'/3'-RACE成功地從甜菜葉片中首次分離了亞硝酸還原酶基因(SbNiR),登錄號(hào):HQ224499,長(zhǎng)度為2014bp,可編碼599個(gè)氨基酸,而且核苷酸序列及其推導(dǎo)出的氨基酸序列與其它植物NiR基因具有較高的同

3、源性。同時(shí)運(yùn)用PCR擴(kuò)增技術(shù)首次克隆了甜菜NiR基因組DNA序列,登錄號(hào)為HQ419065,測(cè)序結(jié)果表明,基因組DNA長(zhǎng)度為2815bp,含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子,內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為532bp,136bp和270bp。
　　 2采用ANTHEPROT軟件分析了SbNiR的理化特性,并運(yùn)用ClustalX服務(wù)器構(gòu)建了NiR的系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明,甜菜NiR為易溶、親水性強(qiáng)的蛋白,理論等電點(diǎn)pHI為7.21,相對(duì)分子量為66.88k

4、Da。甜菜NiR與菠菜(Spinaciaoleracea)NiR的親緣關(guān)系最近。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,NiR的α螺旋在39％左右,β折疊在15％左右,無規(guī)則卷曲在48％左右,表明NiR為混合型蛋白。另外,應(yīng)用同源建模法Geno3d進(jìn)行NiR三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè),NiR共有24個(gè)α螺旋,57個(gè)轉(zhuǎn)角。
　　 3NiR生物進(jìn)化樹分析表明,甜菜NiR與藜科植物NiR親緣關(guān)系較近,與其他植物存在一定差別。在該進(jìn)化樹中同科植物表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系