大白菜BrTCP基因的克隆及生物信息學(xué)分析.pdf

1、TCP家族轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，并且含有一種特有的一種bHLH保守結(jié)構(gòu)區(qū)域。TCP家族基因可能對植物的葉片彎曲以及大小產(chǎn)生影響，但具體的相關(guān)功能研究未見過多報道。本實驗以自交系大白菜‘福山包頭’為材料，分離了擬南芥(Arabidopsis thaliana) TCP的同源基因，將其命名為BrTCP基因，并構(gòu)建了BrTCP基因的表達載體pBI121-BrTCP。為研究大白菜BrTCP基因的功能，我們將該基因轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得了

2、相應(yīng)的純合轉(zhuǎn)基因植株，并觀察轉(zhuǎn)基因植株與野生型是否有明顯的表型性狀。由于在轉(zhuǎn)基因植株與野生型對比中并沒有明顯的表型性狀差別，我們對BrTCP基因做了相關(guān)的生物信息學(xué)分析，希望在下一步的實驗當(dāng)中對其功能性狀作出一定的分析。本實驗對TCP基因功能的進一步研究具有一定的理論價值和實踐意義。
　　 主要結(jié)果如下:
　　 1.BrTCP基因的克隆:
　　 獲得一條分子質(zhì)量約為1200 bp的均一擴增條帶，經(jīng)測序，該DNA片

3、段為1221 bp，與預(yù)期的目的片段大小一致。構(gòu)建的表達載體pBI121-BrTCP經(jīng)PCR、酶切及測序驗證，證明BrTCP基因片段已經(jīng)連接到表達載體PBI121上。
　　 2.PCR及測序鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥:
　　 采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法侵染擬南芥，獲得28棵T0轉(zhuǎn)基因植株。提取轉(zhuǎn)化擬南芥基因組DNA，以35S啟動子的下游引物序列P35SL和BrTCP基因的下游引物序列BrTCPa，擴增外源BrTCP基因，均擴增出約

4、1200bp左右的片段，表明擬南芥均是陽性植株。
　　 將上述PCR擴增出來的目的片段測序結(jié)果與擬南芥TCP基因及我們克隆的BrTCP基因序列比對，結(jié)果表明導(dǎo)入擬南芥的外源基因與大白菜的BrTCP基因完全相同。因此，獲得了可以表達BrTCP基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株。
　　 3.氨基酸序列分析:
　　 發(fā)現(xiàn)了兩個大白菜BrTCP基因的可能的同源基因，分別存在于擬南芥(NM180258)和番茄(SITCP3)中。對這3

5、個基因所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列進行比對分析。結(jié)果表明，大白菜BrTCP蛋白質(zhì)與擬南芥AtTCP蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一致性為75.2％，與番茄SITCP3蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一致性為40.1％。
　　 4.純合轉(zhuǎn)基因植株的獲得:
　　 將獲得的轉(zhuǎn)基因T0代植株在卡那霉素培養(yǎng)皿篩選，陽性植株能夠生長并呈現(xiàn)綠色且生長狀態(tài)同未加抗生素野生型生長相似，一直對轉(zhuǎn)基因植株進行篩選，直至篩到T3代，此時得到的即是轉(zhuǎn)基因植株純合體。

6、>　　 5.轉(zhuǎn)基因植株的性狀觀察:
　　 在含卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上篩選，兩天后野生型開始發(fā)芽，轉(zhuǎn)基因植株沒有變化。6-7 d后轉(zhuǎn)基因植株子葉深綠，根系比野生型發(fā)達，長勢旺盛，并且在此期間，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的根系相比，要明顯的短并且粗壯，而野生型植株的根是非常纖長的。然后將轉(zhuǎn)基因與野生型幼苗移栽入基質(zhì)和蛭石的混合培養(yǎng)基后20 d左右，這個時間內(nèi)轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株幾乎沒有表型變化。在擬南芥植株到達初花期時，可以觀