碭山酥梨果實PPO酶學(xué)特性、PPO克隆及生物信息學(xué)分析.pdf

1、碭山酥梨（Pyrus bretschneideri cv.）是我國栽培面積最大和對外出口的主要梨品種。近幾年，由于自然環(huán)境、品種退化、田間管理粗放等原因，梨果實石細(xì)胞含量增多，導(dǎo)致果實肉質(zhì)變粗，口感多渣，嚴(yán)重影響了碭山酥梨果實的食用品質(zhì)和經(jīng)濟價值。果實中石細(xì)胞是一種厚壁組織細(xì)胞，由次生壁在初生壁上沉積而形成，與木質(zhì)素的合成、轉(zhuǎn)運及沉積密切相關(guān)。因此，對碭山酥梨果實中，石細(xì)胞發(fā)育、木質(zhì)素合成及影響因素的研究就具有重要的意義。木質(zhì)素合成重要

2、酶多酚氧化酶（PPO）可以通過木質(zhì)素單體聚合等多種途徑影響木質(zhì)素的合成。
　　 本實驗以碭山酥梨果實為材料，研究了木質(zhì)素合成重要酶PPO變化規(guī)律，并探討PPO酶學(xué)特性，明確梨果實生長發(fā)育過程中，PPO活性與木質(zhì)素、石細(xì)胞含量之間的關(guān)系。同時，克隆PPOcDNA，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測，為從生理生化和分子生物學(xué)水平了解石細(xì)胞發(fā)育機理，調(diào)節(jié)石細(xì)胞含量奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、碭山酥梨果實發(fā)育過程中，PP

3、O活性在花后27天和47天出現(xiàn)高峰，早于木質(zhì)素含量高峰(花后47天、61天)和石細(xì)胞含量高峰(花后51天)。PPO活性變化與石細(xì)胞、木質(zhì)素含量變化趨勢基本相同，均表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢。作為PPO的一類酶，漆酶在果實發(fā)育發(fā)育初期含量最高，之后迅速下降，花后39天短暫回升后又迅速降低并維持較低水平。相關(guān)性分析表明，PPO活性變化與石細(xì)胞、木質(zhì)素含量極顯著相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)漆酶活性與石細(xì)胞、木質(zhì)素含量間有顯著的相關(guān)性。
　　 2、碭山

4、酥梨果實PPO的最適溫度為40℃左右，且高溫對PPO活性抑制作用比低溫更明顯；不同pH條件下，PPO活性變化表現(xiàn)為雙峰曲線，高峰期分別出現(xiàn)在pH7.0和pH5.0，且pH7.0條件下PPO活性為513.86U·g-1，顯著高于pH5.0條件下PPO活性229.43U·g-1。以鄰苯二酚為底物，梨果實PPO反應(yīng)最適底物濃度是0.16mol·L-1；酶促褐變反應(yīng)動力學(xué)符合米氏方程，動力學(xué)參數(shù)Vmax為54.5455U·g-1，Km為0.13

5、64mol·L-1。
　　 3、蔗糖、山梨醇、EDTA、檸檬酸、抗壞血酸對PPO活性均有一定的抑制作用，同濃度情況下抑制效果為：抗壞血酸＞檸檬酸＞EDTA＞山梨醇＞蔗糖。當(dāng)抑制劑濃度為0.02 mol·L-1時，檸檬酸、抗壞血酸對PPO抑制作用最大，PPO相對活力分別為11.22％和5.24％，濃度高于0.5mol·L-1時，無未檢測到PPO活性。當(dāng)抑制劑濃度從0.02mol·L-1提高到0.5mol·L-1時，EDTA對PPO

6、抑制作用最明顯，PPO殘留活性下降了71.45％。低濃度的蔗糖和山梨醇對PPO活性抑制作用不大，當(dāng)濃度達(dá)到1.0mol·L-1時，PPO殘留活性分別為41.60％和31.20％。
　　 4、利用RTPCR技術(shù)克隆得到碭山酥梨果實PPOcDNA保守片段558bp，該序列已登錄GenBank，登陸號為HQ329065。利用RACE反應(yīng)得到3’片段和5’片段，分別為1326bp和689bp，拼接得到PPOcDNA全長為1992bp，開

7、放讀碼框ORF含有1782個堿基，編碼583個氨基酸，Genbank登錄號為JF809859。
　　 5、對PPO編碼的氨基酸組成、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行生物信息學(xué)分析和預(yù)測。利用ProtParam tool軟件推測氨基酸理論分子量為65.78KD，理論等電點為8.4，偏堿性。
　　 利用ScanProsite在線工具分析氨基酸序列含有兩個結(jié)構(gòu)功能域，與PPO兩個保守的銅離子結(jié)合區(qū)域吻合，具有酪氨酸酶家族的特征。利用DNAman

8、軟件分析和同源性比對，氨基酸序列與同屬薔薇科植物 PPO同源性較高，其中與砂梨PPO相同氨基酸最多，達(dá)到99％。利用SignalP3.0 Server未發(fā)現(xiàn)可能的信號肽切割位點，利用在線ChloroP工具預(yù)測碭山酥梨PPO編碼氨基酸含有一條長度47bp的葉綠體轉(zhuǎn)運肽（CTP），與PredictProtein在線工具預(yù)測PPO亞細(xì)胞定位于葉綠體的結(jié)論一致。
　　 利用PredictProtein和SWISSMODEL在線工具預(yù)測P