參芎注射液對(duì)腹膜透析液誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞損傷的干預(yù)作用研究.pdf

1、背景:
　　 腹膜功能衰竭已成為終末期腎功能不金(ESRD)患者腹膜透析技術(shù)性失敗的最重要的原因,并成為制約腹膜透析(PD)發(fā)展的“瓶頸”。研究表明完整的間皮細(xì)胞層可以顯著廷緩腹膜超濾衰竭的進(jìn)程,組織病理學(xué)也證實(shí)腹膜功能衰竭早期的重要特征表現(xiàn)為腹膜間皮細(xì)胞(PMC)的損傷和腹膜上皮一間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)。因此,防治腹膜纖維化的重要靶點(diǎn)是阻止或逆轉(zhuǎn)腹膜間皮細(xì)胞損傷的發(fā)生或治療EMT所導(dǎo)致的后果如細(xì)胞的移行、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)

2、的合成增多。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)是EMT過(guò)程中關(guān)鍵的細(xì)胞因子,如果能抑制TGF-β的過(guò)度表達(dá),就能抑制其下游相應(yīng)的細(xì)胞因子,從而減緩EMT的發(fā)生和發(fā)展,維護(hù)PMC的結(jié)構(gòu)和功能,維持正常的腹膜功能。
　　 目的:
　　 通過(guò)觀察高糖腹透液誘導(dǎo)的大鼠腹膜纖維化模型,揭示其對(duì)腹膜超濾功能的影響及對(duì)PMC的形態(tài)、數(shù)量及功能變化規(guī)律,以及TGF-β1、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、帶狀封閉蛋白-1(ZO-1)、水通

3、道蛋白-1(AQP-1)等細(xì)胞因子在腹膜組織中的表達(dá)情況。并通過(guò)中藥復(fù)方制劑參芎注射液進(jìn)行干預(yù),探討在大鼠腹膜纖維化過(guò)程中參芎注射液對(duì)PMC保護(hù)的可能機(jī)制。并通過(guò)臨床研究,觀察參芎注射液對(duì)腹透患者超濾量的影響及其對(duì)PMC的保護(hù)作用。
　　 方法:
　　 1、大鼠腹膜透析模型的建立及超濾量的觀察:SD大鼠分A、B兩組,均給予4.25％腹透液(PDF)透析,A組透析劑量為100 ml/Kg,B組透析劑量為200 ml/Kg;

4、分別測(cè)定兩組在1h、2h、3h、4h超濾量。
　　 2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分:建立高糖誘導(dǎo)的大鼠腹膜纖維化模型,40只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、低劑量組和高劑量組,每組10只?？瞻捉M:不作任何處理和干預(yù);模型組:4.25%PDF100 ml/Kg腹腔注射,每日1次;低劑量組:4.25%PDF87.5 ml/Kg+參芎注射液12.5ml/Kg腹腔注射,每日1次;高劑量組:4.25%PDF75 ml/Kg+參芎注射液25ml/Kg腹腔注射

5、,每日1次。實(shí)驗(yàn)4周后處死大鼠作檢測(cè)。行4h腹膜平衡試驗(yàn)(PET),測(cè)定透析液肌酐濃度(Dor),血漿肌酐濃度(Pcr),初始腹膜透析液葡萄糖濃度(D0),4h透析液葡萄糖濃度(D4),計(jì)算D/Pcr、D4/D0。計(jì)量各組大鼠PD平均超濾量。大鼠腹膜行HE和VG染色,采用Image-ProPlus6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)量間皮下紅色的纖維組織厚度。大鼠腹膜標(biāo)本行超薄切片,透射電子顯微鏡觀察病理改變。電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)腹透引流液中CA125濃度

6、,計(jì)算CA125表達(dá)率。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腹膜TGF-β1、bFGF、ZO-1、AQP-1表達(dá)水平。選擇背景清晰且陽(yáng)性表達(dá)好的切片作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野(200×),計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞,以10個(gè)高倍視野總數(shù)作為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
　　 3、臨床研究部分:選擇武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院64例病情穩(wěn)定,透析時(shí)間超過(guò)3個(gè)月的腹透患者,予參芎葡萄糖注射液50ml加入每袋(2L)腹透液,行標(biāo)準(zhǔn)CAPD,療程為7天。治療前后行標(biāo)準(zhǔn)腹膜平

7、衡試驗(yàn),生化指標(biāo)檢測(cè),腹透引流液CA125濃度檢測(cè),計(jì)算透析前后的尿素清除指數(shù)(KT/V),肌酐清除率(Ccr)。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS17.0,實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為定量數(shù)據(jù),用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,各組間差異性比較采用單因素方差分析并進(jìn)行兩兩比較(LSD法),P＜0.05(雙側(cè))為差異有顯著性意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、大鼠超濾量實(shí)驗(yàn)部分:A、B兩組在留腹1h、2h、3h、4

8、h的超濾量均逐漸增加,A組2h平均超濾量為10.46ml,較1h的平均超濾量9.57ml增加無(wú)顯著差異(p＞0.05),A組3h、4h平均超濾量12.85ml和13.84ml較1h和2h超濾量增加均有顯著差異(p＜0.05)。B組2h平均超濾量11.14ml,較1h的9.15ml增加有顯著差異(p＜0.05);B組3h、4h的超濾量15.09 ml和16.1ml較1h、2h增加均有顯著差異(p＜0.05)。B組第3h、4h超濾量顯著高于

9、A組同時(shí)間段的超濾量(p＜0.05)。
　　 2、空白組、模型組、低劑量組和高劑量組之間超濾量的比較,空白組的平均超濾量為13.75±1.17 ml,較模型組4.53±1.10 ml明顯高,低劑量組的超濾量有明顯改善,達(dá)到7.46±1.23ml,高劑量組有更為顯著的改善,為9.73±1.11 ml。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組間均有顯著性差異(P＜0.05).
　　 3、空白組、模型組、低劑量組和高劑量組之間腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能的比較,D/

10、Pcr以模型組升高最為顯著,達(dá)到0.84±0.07,較空白組0.53±0.03升高明顯。低劑量組和高劑量組D/Pcr分別為0.76±0.08,0.65±0.12,均能減緩D/Pcr的上升,以高劑量組更為明顯。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組間均有顯著性差異(P＜0.05)。D4/D0的比較,四組分別為0.59±0.04,0.38±0.06,0.45±0.05,0.51±0.04,各組間均有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 4、采用電化學(xué)發(fā)光法

11、檢測(cè)各組腹透引流液CA125濃度及表達(dá)率,空白組CA125濃度為11.99±1.37 U/ml,CA125表現(xiàn)率為2.19±0.30 U/ml,模型組有顯著下降,分別為3.53±0.51 U/ml,0.51±0.12 U/ml。低劑量干預(yù)后上升為6.46±0.89 U/ml和1.01±0.15 U/ml;高劑量干預(yù)后為7.96±0.97 U/ml,1.32±0.16 U/ml。各組組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　

12、5、PMC形態(tài)及各組腹膜厚度比較,空白組為22.2±5.1μm,模型組明顯增厚為97.7±18.3μm,低、高劑量組有不同程度增厚,分別為57.9士7.8μm,46.1±7.2μm。各組組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。光鏡下,空白對(duì)照組腹膜由一層扁平間皮細(xì)胞覆蓋,間皮細(xì)胞基本完整、連續(xù)分布,間皮下覆有疏松結(jié)締組織,結(jié)締組織未見(jiàn)明顯增生;模型組及低劑量、高劑量組壁層腹膜明顯增厚、疏松,間皮細(xì)胞脫落,間皮下有大量的膠原纖維沉積,尤以模

13、型組明顯。
　　 6、超微結(jié)構(gòu)的比較?？瞻讓?duì)照組:腹膜間皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞無(wú)皺縮、變形;細(xì)胞游離面微絨毛豐富,分布均勻;細(xì)胞器清晰,見(jiàn)吞飲泡、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等,細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰;相鄰間皮細(xì)胞間緊密連接完整。模型組:偶見(jiàn)少量間皮細(xì)胞,大部分脫落,細(xì)胞變形,微絨毛稀疏可見(jiàn),細(xì)胞內(nèi)線粒體等細(xì)胞器明顯腫脹,結(jié)構(gòu)破壞。間皮下纖維組織增生明顯。低劑量組:間皮細(xì)胞疏松,細(xì)胞表面不連續(xù),徼絨毛明顯減少,細(xì)胞器腫脹,胞核染色質(zhì)邊集、凝固,相鄰間皮

14、細(xì)胞緊密連接消失。高劑量組:間皮細(xì)胞疏松,細(xì)胞表面不連續(xù),微絨毛分布稀疏,胞漿內(nèi)可見(jiàn)吞飲泡、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器,細(xì)胞核染色質(zhì)邊集,相鄰間皮細(xì)胞少見(jiàn)緊密連接。
　　 7、腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1、bFGF、ZO-1、AQP-1的表達(dá)。空白組腹膜組織中PMC陽(yáng)性表達(dá)TGF-β1的細(xì)胞數(shù)為36.21±3.53,較模型組62.24±4.46低,低劑量組和高劑量組分別為56.43±5.00,48.15±8.72。各組間比較有顯著性差異

15、(P＜0.05)。四組中bFGF陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)分別為13.46±1.41,24.54±3.12,19.20±3.36,16.94±2.54,各組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。腹膜組織中ZO-1陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)分別為33.24±2.21,4.36±2.53,10.44±3.11,17.86±2.93。各組間比較也有顯著性差異(P＜0.05)。腹膜組織中AQP-1陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)分別為21.88±1.17,14.36±2.16,16

16、.86±1.51,17.90±0.81。各組間比較也有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 8、臨床觀察中發(fā)現(xiàn)治療后患者超濾量由治療前320±65ml/d明顯提高到662±85ml/d,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有非常顯著性差異(P＜0.01)。腹透引流液CA125平均濃度由治療前的14.6±3.6U/ml提高到17.8±3.2U/ml,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異(P＜0.05)。而患者的殘余尿量治療前為360±116ml/d,治療后為365±118

17、 ml/d;KT/V治療前為1.88±0.38,治療后為1.92±0.41;D/Pcr治療前為0.63±0.18,治療后為0.66±0.17。均未見(jiàn)明顯改變,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P＞0.05。
　　 結(jié)論:
　　 1、高糖腹透液能損傷PMC,促進(jìn)纖維化。高糖腹透液誘導(dǎo)PMC過(guò)度表達(dá)TGF-β,使bFGF的表達(dá)上調(diào),促進(jìn)纖維化的發(fā)生和發(fā)展,導(dǎo)致超濾功能的障礙;高糖腹透液在導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生和發(fā)展的同時(shí),還使PMC間的正常連接松散或

18、破壞,細(xì)胞凋亡加速,使水通道蛋白的減少,也導(dǎo)致超濾功能的障礙。
　　 2、在高糖誘導(dǎo)的PMC損傷過(guò)程中,通過(guò)在腹透液中加入?yún)④鹤⑸湟嚎梢云鸬礁深A(yù)EMT過(guò)程,保護(hù)PMC之間的細(xì)胞連接,減少細(xì)胞凋亡,維持腹膜組織的完整性。
　　 3、參芎注射液也能通過(guò)拮抗TGF-β、bFGF過(guò)度表達(dá),從而減緩腹膜纖維化的發(fā)生;通過(guò)保護(hù)PMC,上調(diào)ZO-1、AQP-1表達(dá),達(dá)到阻止、延緩腹膜纖維化的進(jìn)程,增加腹透超濾量,提高腹膜透析效能。