參芎注射液對腹膜透析液誘導的腹膜間皮細胞損傷的干預作用研究.pdf

1、背景:
　　 腹膜功能衰竭已成為終末期腎功能不金(ESRD)患者腹膜透析技術性失敗的最重要的原因,并成為制約腹膜透析(PD)發(fā)展的“瓶頸”。研究表明完整的間皮細胞層可以顯著廷緩腹膜超濾衰竭的進程,組織病理學也證實腹膜功能衰竭早期的重要特征表現(xiàn)為腹膜間皮細胞(PMC)的損傷和腹膜上皮一間皮細胞轉分化(EMT)。因此,防治腹膜纖維化的重要靶點是阻止或逆轉腹膜間皮細胞損傷的發(fā)生或治療EMT所導致的后果如細胞的移行、細胞外基質(ECM)

2、的合成增多。轉化生長因子-β(TGF-β)是EMT過程中關鍵的細胞因子,如果能抑制TGF-β的過度表達,就能抑制其下游相應的細胞因子,從而減緩EMT的發(fā)生和發(fā)展,維護PMC的結構和功能,維持正常的腹膜功能。
　　 目的:
　　 通過觀察高糖腹透液誘導的大鼠腹膜纖維化模型,揭示其對腹膜超濾功能的影響及對PMC的形態(tài)、數(shù)量及功能變化規(guī)律,以及TGF-β1、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、帶狀封閉蛋白-1(ZO-1)、水通

3、道蛋白-1(AQP-1)等細胞因子在腹膜組織中的表達情況。并通過中藥復方制劑參芎注射液進行干預,探討在大鼠腹膜纖維化過程中參芎注射液對PMC保護的可能機制。并通過臨床研究,觀察參芎注射液對腹透患者超濾量的影響及其對PMC的保護作用。
　　 方法:
　　 1、大鼠腹膜透析模型的建立及超濾量的觀察:SD大鼠分A、B兩組,均給予4.25％腹透液(PDF)透析,A組透析劑量為100 ml/Kg,B組透析劑量為200 ml/Kg;

4、分別測定兩組在1h、2h、3h、4h超濾量。
　　 2、動物實驗部分:建立高糖誘導的大鼠腹膜纖維化模型,40只大鼠隨機分為空白組、模型組、低劑量組和高劑量組,每組10只。空白組:不作任何處理和干預;模型組:4.25%PDF100 ml/Kg腹腔注射,每日1次;低劑量組:4.25%PDF87.5 ml/Kg+參芎注射液12.5ml/Kg腹腔注射,每日1次;高劑量組:4.25%PDF75 ml/Kg+參芎注射液25ml/Kg腹腔注射

5、,每日1次。實驗4周后處死大鼠作檢測。行4h腹膜平衡試驗(PET),測定透析液肌酐濃度(Dor),血漿肌酐濃度(Pcr),初始腹膜透析液葡萄糖濃度(D0),4h透析液葡萄糖濃度(D4),計算D/Pcr、D4/D0。計量各組大鼠PD平均超濾量。大鼠腹膜行HE和VG染色,采用Image-ProPlus6.0圖像分析系統(tǒng)測量間皮下紅色的纖維組織厚度。大鼠腹膜標本行超薄切片,透射電子顯微鏡觀察病理改變。電化學發(fā)光法檢測腹透引流液中CA125濃度

6、,計算CA125表達率。免疫組織化學法檢測腹膜TGF-β1、bFGF、ZO-1、AQP-1表達水平。選擇背景清晰且陽性表達好的切片作統(tǒng)計學分析,每張切片隨機選擇10個高倍視野(200×),計數(shù)陽性細胞,以10個高倍視野總數(shù)作為陽性細胞數(shù)。
　　 3、臨床研究部分:選擇武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院64例病情穩(wěn)定,透析時間超過3個月的腹透患者,予參芎葡萄糖注射液50ml加入每袋(2L)腹透液,行標準CAPD,療程為7天。治療前后行標準腹膜平

7、衡試驗,生化指標檢測,腹透引流液CA125濃度檢測,計算透析前后的尿素清除指數(shù)(KT/V),肌酐清除率(Ccr)。
　　 4、統(tǒng)計學方法
　　 統(tǒng)計軟件為SPSS17.0,實驗結果均為定量數(shù)據(jù),用均數(shù)±標準差(x±s)表示,各組間差異性比較采用單因素方差分析并進行兩兩比較(LSD法),P＜0.05(雙側)為差異有顯著性意義。
　　 結果:
　　 1、大鼠超濾量實驗部分:A、B兩組在留腹1h、2h、3h、4

8、h的超濾量均逐漸增加,A組2h平均超濾量為10.46ml,較1h的平均超濾量9.57ml增加無顯著差異(p＞0.05),A組3h、4h平均超濾量12.85ml和13.84ml較1h和2h超濾量增加均有顯著差異(p＜0.05)。B組2h平均超濾量11.14ml,較1h的9.15ml增加有顯著差異(p＜0.05);B組3h、4h的超濾量15.09 ml和16.1ml較1h、2h增加均有顯著差異(p＜0.05)。B組第3h、4h超濾量顯著高于

9、A組同時間段的超濾量(p＜0.05)。
　　 2、空白組、模型組、低劑量組和高劑量組之間超濾量的比較,空白組的平均超濾量為13.75±1.17 ml,較模型組4.53±1.10 ml明顯高,低劑量組的超濾量有明顯改善,達到7.46±1.23ml,高劑量組有更為顯著的改善,為9.73±1.11 ml。經統(tǒng)計學處理各組間均有顯著性差異(P＜0.05).
　　 3、空白組、模型組、低劑量組和高劑量組之間腹膜轉運功能的比較,D/

10、Pcr以模型組升高最為顯著,達到0.84±0.07,較空白組0.53±0.03升高明顯。低劑量組和高劑量組D/Pcr分別為0.76±0.08,0.65±0.12,均能減緩D/Pcr的上升,以高劑量組更為明顯。經統(tǒng)計學處理各組間均有顯著性差異(P＜0.05)。D4/D0的比較,四組分別為0.59±0.04,0.38±0.06,0.45±0.05,0.51±0.04,各組間均有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 4、采用電化學發(fā)光法

11、檢測各組腹透引流液CA125濃度及表達率,空白組CA125濃度為11.99±1.37 U/ml,CA125表現(xiàn)率為2.19±0.30 U/ml,模型組有顯著下降,分別為3.53±0.51 U/ml,0.51±0.12 U/ml。低劑量干預后上升為6.46±0.89 U/ml和1.01±0.15 U/ml;高劑量干預后為7.96±0.97 U/ml,1.32±0.16 U/ml。各組組間比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。
　　

12、5、PMC形態(tài)及各組腹膜厚度比較,空白組為22.2±5.1μm,模型組明顯增厚為97.7±18.3μm,低、高劑量組有不同程度增厚,分別為57.9士7.8μm,46.1±7.2μm。各組組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。光鏡下,空白對照組腹膜由一層扁平間皮細胞覆蓋,間皮細胞基本完整、連續(xù)分布,間皮下覆有疏松結締組織,結締組織未見明顯增生;模型組及低劑量、高劑量組壁層腹膜明顯增厚、疏松,間皮細胞脫落,間皮下有大量的膠原纖維沉積,尤以模

13、型組明顯。
　　 6、超微結構的比較?？瞻讓φ战M:腹膜間皮細胞結構完整,細胞無皺縮、變形;細胞游離面微絨毛豐富,分布均勻;細胞器清晰,見吞飲泡、線粒體、內質網等,細胞核結構清晰;相鄰間皮細胞間緊密連接完整。模型組:偶見少量間皮細胞,大部分脫落,細胞變形,微絨毛稀疏可見,細胞內線粒體等細胞器明顯腫脹,結構破壞。間皮下纖維組織增生明顯。低劑量組:間皮細胞疏松,細胞表面不連續(xù),徼絨毛明顯減少,細胞器腫脹,胞核染色質邊集、凝固,相鄰間皮

14、細胞緊密連接消失。高劑量組:間皮細胞疏松,細胞表面不連續(xù),微絨毛分布稀疏,胞漿內可見吞飲泡、線粒體、內質網等細胞器,細胞核染色質邊集,相鄰間皮細胞少見緊密連接。
　　 7、腹膜間皮細胞TGF-β1、bFGF、ZO-1、AQP-1的表達。空白組腹膜組織中PMC陽性表達TGF-β1的細胞數(shù)為36.21±3.53,較模型組62.24±4.46低,低劑量組和高劑量組分別為56.43±5.00,48.15±8.72。各組間比較有顯著性差異

15、(P＜0.05)。四組中bFGF陽性表達的細胞數(shù)分別為13.46±1.41,24.54±3.12,19.20±3.36,16.94±2.54,各組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。腹膜組織中ZO-1陽性表達的細胞數(shù)分別為33.24±2.21,4.36±2.53,10.44±3.11,17.86±2.93。各組間比較也有顯著性差異(P＜0.05)。腹膜組織中AQP-1陽性表達的細胞數(shù)分別為21.88±1.17,14.36±2.16,16

16、.86±1.51,17.90±0.81。各組間比較也有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 8、臨床觀察中發(fā)現(xiàn)治療后患者超濾量由治療前320±65ml/d明顯提高到662±85ml/d,統(tǒng)計學處理有非常顯著性差異(P＜0.01)。腹透引流液CA125平均濃度由治療前的14.6±3.6U/ml提高到17.8±3.2U/ml,統(tǒng)計學處理有顯著性差異(P＜0.05)。而患者的殘余尿量治療前為360±116ml/d,治療后為365±118

17、 ml/d;KT/V治療前為1.88±0.38,治療后為1.92±0.41;D/Pcr治療前為0.63±0.18,治療后為0.66±0.17。均未見明顯改變,統(tǒng)計學處理P＞0.05。
　　 結論:
　　 1、高糖腹透液能損傷PMC,促進纖維化。高糖腹透液誘導PMC過度表達TGF-β,使bFGF的表達上調,促進纖維化的發(fā)生和發(fā)展,導致超濾功能的障礙;高糖腹透液在導致腹膜纖維化的發(fā)生和發(fā)展的同時,還使PMC間的正常連接松散或

18、破壞,細胞凋亡加速,使水通道蛋白的減少,也導致超濾功能的障礙。
　　 2、在高糖誘導的PMC損傷過程中,通過在腹透液中加入?yún)④鹤⑸湟嚎梢云鸬礁深AEMT過程,保護PMC之間的細胞連接,減少細胞凋亡,維持腹膜組織的完整性。
　　 3、參芎注射液也能通過拮抗TGF-β、bFGF過度表達,從而減緩腹膜纖維化的發(fā)生;通過保護PMC,上調ZO-1、AQP-1表達,達到阻止、延緩腹膜纖維化的進程,增加腹透超濾量,提高腹膜透析效能。