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文檔簡介
1、目的:糖尿病足是糖尿病患者嚴重的并發(fā)癥之一,其發(fā)生的主要原因有血管病變、神經(jīng)病變、感染、下肢動脈硬化缺血及局部微環(huán)境的異常等,常遷延不愈。目前導(dǎo)致其遷延不愈的機制尚不十分清楚。血小板源生長因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)只有與其受體特異性結(jié)合后才能發(fā)揮其在創(chuàng)面愈合中的作用,本研究通過觀察糖尿病足創(chuàng)面和非糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織中血小板源生長因子受體α(platelet derived growt
2、h factor receptorα,PDGFR-α)含量,進一步探討糖尿病足創(chuàng)面遷延不愈的原因。
方法:
1.根據(jù)納入標準和排除標準,選取2015年1月至2016年6月于白求恩國際和平醫(yī)院住院的糖尿病足潰瘍患者10例,非糖尿病足潰瘍患者10例,作為對照組。
2.兩組患者于入院后均給予常規(guī)清創(chuàng)處理,時間為10-15天。創(chuàng)面準備完畢后取各組患者創(chuàng)面中的新鮮肉芽組織,并將取材的肉芽組織分為兩份。一份經(jīng)4%多聚甲
3、醛溶液固定后,對標本進行HE染色和免疫組織化學染色觀察。另外一份取材后立刻放入液氮中,使其迅速冷卻,然后將組織標本迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中儲存,用于Western blot分析和Real-time PCR檢測。
3.在光學顯微鏡下(400×)觀察兩組HE染色切片中肉芽組織形態(tài),并在每個HE染色切片上隨機選取10個視野,計數(shù)每個視野中毛細血管數(shù)量,取其平均值進行統(tǒng)計,觀察創(chuàng)面肉芽組織生長情況。
4.取上述石蠟切片進行免
4、疫組織化學染色,對PDGFR-α表達情況進行定量分析。首先在光學顯微鏡下(400×)對PDGFR-α表達情況進行觀察,鏡下棕黃色或黃褐色顆粒代表PDGFR-α染色陽性。在每個染色切片上隨機選擇10個熱點區(qū)域進行拍照,用數(shù)字醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(MoticMedical6.0)對所選視野行PDGFR-α光密度值檢測,取平均光密度值(optical density, OD),應(yīng)用平均光密度值對PDGFR-α進行半定量分析。
5.應(yīng)用W
5、estern blot分析在蛋白水平觀察PDGFR-α表達情況。首先用Image J軟件分析兩組PDGFR-α條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參照蛋白,結(jié)果以PDGFR-α與GAPDH條帶灰度的比值來表示每個條帶中PDGFR-α的相對表達量,對PDGFR-α進行蛋白定量分析。
6.應(yīng)用Real-time PCR檢測在基因水平觀察PDGFR-α表達情況。對兩組創(chuàng)面肉芽組織進行Real-time PCR檢測,得到各目的基因表達相對定量
6、值,即PDGFR-αmRNA表達量,對PDGFR-α進行基因定量分析。
結(jié)果:
1.肉芽組織觀察:肉眼觀察糖尿病足創(chuàng)面和非糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織,對照組肉芽組織新鮮,表現(xiàn)為肉芽組織鮮紅色,如顆粒樣生長,觸感較濕潤柔軟,取材時出血明顯。與對照組相比,糖尿病足組創(chuàng)面肉芽組織老化,表現(xiàn)為顆粒狀生長不明顯,觸感較韌。
2.肉芽組織HE染色:在顯微鏡下觀察兩組HE染色切片,對照組創(chuàng)面肉芽組織可見毛細血管密集,大量成纖維
7、細胞增殖。與對照組相比,糖尿病足組創(chuàng)面肉芽組織毛細血管較稀疏,成纖維細胞數(shù)量較少。對平均毛細血管數(shù)進行統(tǒng)計分析,糖尿病足組毛細血管數(shù)量較對照組明顯下降(P<0.01)。
3.免疫組織化學染色切片鏡下觀察:兩組均可見PDGFR-α表達陽性的棕黃色、黃褐色顆粒,其中對照組創(chuàng)面肉芽組織切片棕黃色顆粒數(shù)量較多,與對照組相比,糖尿病足組肉芽組織切片陽性表達的棕黃色顆粒顯著減少。用平均光密度值代表PDGFR-α表達量,對PDGFR-α進行
8、半定量分析,糖尿病足組創(chuàng)面肉芽組織PDGFR-α平均光密度值明顯低于對照組(P<0.05)。
4.Western blot分析結(jié)果顯示:統(tǒng)計兩組PDGFR-α與GAPDH條帶灰度的比值,對PDGFR-α表達情況進行定量分析。對照組肉芽組織中PDGFR-α相對蛋白表達值是0.61±0.13,糖尿病足組肉芽組織中PDGFR-α相對蛋白表達值為0.33±0.10,糖尿病足組創(chuàng)面肉芽組織中PDGFR-α相對蛋白表達值低于對照組(P<0
9、.01)。
5.Real-time PCR檢測結(jié)果顯示:應(yīng)用PCR檢測兩組創(chuàng)面肉芽組織PDGFR-α基因表達情況,對PDGFR-α基因表達相對定量值進行統(tǒng)計分析。對照組肉芽組織中PDGFR-α相對基因表達值是1.32±0.49,糖尿病足組肉芽組織中PDGFR-α相對基因表達值為0.79±0.16,糖尿病足組創(chuàng)面肉芽組織PDGFR-αmRNA含量明顯低于對照組(P<0.01)。
結(jié)論:
1.對照組創(chuàng)面肉芽組織
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