HLA-DRB1共同表位在類風濕關(guān)節(jié)炎中作用機制及與強直性脊柱炎關(guān)聯(lián)性的研究.pdf

1、背景和目的:
　　類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性滑膜炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，常導致關(guān)節(jié)破壞和殘疾。發(fā)病機制尚不十分明確，與遺傳、環(huán)境因素及自身免疫功能紊亂等有關(guān)。其中遺傳因素約起到了60％的作用，HLA-DRB1等位基因編碼的五氨基酸序列QKAA，QRRAA或RRRAA與該病關(guān)系密切，被稱為共同表位(shared epitope，SE)。共同表位存在三個同源的氨基酸序列:1、QKR

2、AA主要由HLA-DRB1*0401等位基因編碼;2、QRRAA，主要由HLA-DRB1*0404、HLA-DRB1*0101和HLA-DRB1*0405等位基因編碼;3、RRRAA，由HLA-DRB1*1001等位基因編碼，其中QKRAA在白種人中最常見，RRRAA在所有人群中最為罕見。然而，這些研究多基于遺傳學研究，共同表位在類風濕關(guān)節(jié)炎中起到何種作用，其機制如何，目前尚不明確。
　　除類風濕關(guān)節(jié)炎外，多項研究表明HLA-DR

3、B1共同表位與其他疾病相關(guān)。人類疾病中，風濕性多肌痛、巨細胞動脈炎、Ⅰ型糖尿病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、狼瘡、自身免疫性肝炎以及早發(fā)性慢性淋巴性白血病相關(guān)。另外，HLA-DRB1共同表位與犬的自發(fā)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)。在HLA-DRB1*0401轉(zhuǎn)基因小鼠中，共同表位與自發(fā)糖尿病的發(fā)病率、膠原誘導關(guān)節(jié)炎及自身免疫性腦脊髓炎的疾病嚴重度相關(guān)。然而，同樣與HLA-DRB1有著相關(guān)性的強直性脊柱炎是否與共同表位相關(guān)，目前未見報道。
　　因此，本研究旨在探

4、討HLA-DRB1共同表位在類風濕關(guān)節(jié)炎中介導的免疫反應(yīng)，以及HLA-DRB1共同表位與強直性脊柱炎的關(guān)系。
　　第一部分 HLA-DRB1共同表位在類風濕關(guān)節(jié)炎中對CD3+CD4+T淋巴細胞的作用
　　目的:
　　觀察類風濕關(guān)節(jié)炎患者CD3+CD4+T淋巴細胞對共同表位的免疫反應(yīng)，探討共同表位在類風濕關(guān)節(jié)炎中的作用和機理。
　　方法:
　　1.采集類風濕關(guān)節(jié)炎患者外周靜脈血18例，健康人外周靜脈血17例。

5、
　　2.使用QIAGEN DNA抽提試劑盒，從外周血中抽提DNA。
　　3.采用SSP-PCR法對DNA樣本進行HLA-DRB1基因分型，先進行HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*4以及HLA-DRB1*10進行低分辨分型。再對HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*04進行高分辨分型，根據(jù)PCR條帶確定基因型。
　　4.外周血單個核細胞(PBMC)的分離收集，采用密度梯度離心法（Ficoll分離）。

6、　　5.將PBMC分為五組，分別加入刺激物刺激6小時。第一組為陽性對照組，加入佛波酯(PMA)和離子霉素(Ionomycin);第二組加入HLA-DRB1*0401肽段（KDLLEQKRAAVDTYC）;第三組加入HLA-DRB1*0405肽段（KDLLEQRRAAVDTYC）;第四組加入 HLD-DRB1*0402肽段(KDILEDERAAVDTYC);第五組加入培養(yǎng)基為空白對照組。
　　6.PBMC使用熒光染料標記表面標志CD

7、3+和CD4+，破膜，熒光染料標記胞內(nèi)細胞因子IFN-γ、IL-17，流式細胞儀檢測。結(jié)果以IFN-γ、IL-17陽性反應(yīng)細胞占比表示。
　　7.數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤表示，數(shù)據(jù)使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，多組數(shù)據(jù)間的比較采用Kruskal-WallisTest，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用Nemenyi Test。顯著性檢驗P＜0.05，即判斷為有統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論:
　　1.HLA-DRB1共同表位可刺激共同表

8、位陽性的類風濕關(guān)節(jié)炎患者CD3+CD4+T淋巴細胞產(chǎn)生更多的IFN-γ，導致類風濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生以及疾病嚴重程度的加重。
　　2.在類風濕關(guān)節(jié)炎中，HLA-DRB1共同表位不能刺激CD3+CD4+T淋巴細胞產(chǎn)生IL-17。
　　第二部分 HLA-DRB1共同表位在類風濕關(guān)節(jié)炎中對CD11c+CD8-樹突狀細胞的作用
　　目的:
　　觀察類風濕關(guān)節(jié)炎患者CD11c+CD8-樹突狀細胞(DCs)對共同表位的免疫應(yīng)答，探

9、討共同表位在類風濕關(guān)節(jié)炎中的作用和機理。
　　方法:
　　1.收集類風濕關(guān)節(jié)炎患者外周靜脈血12例。
　　2.使用QIAGEN DNA抽提試劑盒，從外周血中抽提DNA。
　　3.采用SSP-PCR法對DNA樣本進行HLA-DRB1基因分型，先進行HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*4以及HLA-DRB1*10進行低分辨分型。再對HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*04進行高分辨分型，根據(jù)PCR條帶確定

10、基因型。
　　4.外周血單個核細胞(PBMC)的分離收集，采用密度梯度離心法（Ficoll分離）。
　　5.采用貼壁法培養(yǎng)樹突狀細胞(DCs)，分別于第1、3、5天加入GM-CSF、IL-4，第6天收集DCs。
　　6.熒光染料標記DCs表面標志CD11c、CD83，流式細胞儀檢測。
　　7.將DCs分為五組，分別加入刺激物刺激6小時。第一組為陽性對照組，加入TNF-α;第二組加入HLA-DRB1*0401肽段(

11、KDLLEQKRAAVDTYC);第三組加入HLA-DRB1*0405肽段(KDLLEQRRAAVDTYC);第四組加入HLD-DRB1*0402肽段(KDILEDERAAVDTYC);第五組加入培養(yǎng)基為空白對照組。
　　8.熒光染料標記DCs，選擇CD11c+CD8-細胞，破膜，熒光染料標記胞內(nèi)細胞因子IL-6，流式細胞儀檢測。結(jié)果以IL-6陽性反應(yīng)細胞占比表示。
　　9.數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤表示，使用統(tǒng)計軟件SPSS19

12、.0進行分析，多組數(shù)據(jù)之間的比較采用Kruskal-Wallis Test。顯著性檢驗P＜0.05，即判斷為有統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)果:
　　1.基因分型結(jié)果顯示:共同表位陽性6例，其中基因型為HLA-DRB1*0401的2例，HLA-DRB1*0405的4例;共同表位陰性6例。
　　2.培養(yǎng)至第6天的DCs表型鑒定CD11c的比例為89.74±2.80％，CD83+的比例為6.81±1.04％，結(jié)合鏡下形態(tài)，為未成熟D

13、Cs。
　　3.HLA-DRB1*0401肽段(KDLLEQKRAAVDTYC)刺激后，HLA-DRB1*0401者CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例為0％; HLA-DRB1*0405者CD11 c+CD8-DCs產(chǎn)生IL-6的比例為1.66±0.32;共同表位陰性者CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例為0.83±0.46％。
　　HLA-DRB1*0405肽段(KDLLEQRRAAVDTYC)刺激后，HLA

14、-DRB1*0401者CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例為0.04±0.04％; HLA-DRB1*0405者CD11c+CDS-IL-6+DCs比例為0.11±0.07％;共同表位陰性者CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例為0.52±0.18％。
　　HLD-DRB1*0402肽段(KDILEDERAAVDTYC)刺激后，HLA-DRB1*0401純合者CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例為0.03±0.03

15、％;HLA-DRB1*0405純合者CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例為0.11±0.11％;共同表位陰性者CD11c+CD8-IL-6+DCs比例為0.26±0.17％。
　　4.共同表位陽性和陰性者類風濕關(guān)節(jié)炎患者其CD11c+CD8-DCs經(jīng)三組肽段刺激后產(chǎn)生IL-6的比例均無顯著性差異（P=0.304＞0.05和P=0.354＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　在類風濕關(guān)節(jié)炎中，HLA-DRB1共同表位不能

16、刺激CD11c+CD8-樹突狀細胞產(chǎn)生IL-6。
　　第三部分 HLA-DRB1共同表位與強直性脊柱炎的關(guān)系
　　目的:
　　探討HLA-DRB1共同表位與強直性脊柱炎的關(guān)聯(lián)性。
　　方法:
　　1.采集182例強直性脊柱炎患者的DNA樣本。健康對照組數(shù)據(jù)采用第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院風濕免疫科實驗室對404名健康人的HLA-DRB1基因分型結(jié)果。
　　2.采用SSP-PCR法對DNA樣本進行HLA-DRB

17、1基因分型，先進行HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*04以及HLA-DRB1*10進行低分辨分型。再對HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*04進行高分辨分型，根據(jù)PCR條帶確定基因型。
　　3.應(yīng)用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用Chi-square Test檢驗。顯著性檢驗P＜0.05，認為有統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)果:
　　1.強直性脊柱炎患者中，共同表位陽性者37例，比例為20.33％;健康人中，