富含半胱氨酸腸蛋白1(CRIP1)通過(guò)調(diào)控Fas-FasL凋亡信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌增殖的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是我國(guó)前三位最常見的惡性腫瘤，同時(shí)也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因之一，近年來(lái)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。雖然在結(jié)直腸癌發(fā)病初期，90％的病人可手術(shù)治療治愈，可是大部分病人在確診時(shí)已是癌癥晚期，預(yù)后極差。CRIP1是LIM家族成員，蛋白分子量8kDa，屬于小分子量蛋白，已經(jīng)有研究結(jié)果表明，CRIP1在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌及胰腺癌中高表達(dá)，并對(duì)疾病的預(yù)后有重要影

2、響，而在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及功能還不甚清楚，本課題立意研究CRIP1對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響及調(diào)控機(jī)制，爭(zhēng)取為結(jié)直腸癌的有效治療找到新的靶點(diǎn)或途徑。
　　方法:
　　1.分析CRIP1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)CRIP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的mRNA水平，免疫印跡檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平，以及免疫組化探索在結(jié)直腸癌組織及癌周組織的表達(dá)情況;
　　2.構(gòu)建CRIP1過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后CCK8及EDU增殖

3、實(shí)驗(yàn)研究過(guò)表達(dá)CRIP1后對(duì)SW620細(xì)胞增殖能力的影響，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況，并同時(shí)采用Tunel細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。另采用5-氟尿嘧啶(5-FU)處理細(xì)胞，觀察CRIP1過(guò)表達(dá)對(duì)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響;
　　3.構(gòu)建CRIP1干擾片段，采用上述相同研究方案進(jìn)行驗(yàn)證;
　　4.免疫印跡探究CRIP1對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控情況，特別是對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞Fas和FasL的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，其中FasL的檢測(cè)采

4、用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定，后利用流式細(xì)胞儀及細(xì)胞成像法進(jìn)行恢復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證CRIP1在Fas/FasL通路調(diào)控中的關(guān)鍵作用;
　　5.探究CRIP1對(duì)Fas的調(diào)控機(jī)制，使用熒光定量RT-PCR及免疫印跡探究CRIP1對(duì)Fas在mRNA水平及蛋白水平的影響，然后通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(CO-IP)對(duì)CRIP1及Fas之間相互作用及泛素化調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探究。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
　　使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行

5、分析(SPSSChicago，USA)，定量數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。
　　結(jié)果:
　　1.熒光定量RT-PCR和免疫印跡檢測(cè)CRIP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中mRNA水平及蛋白水平均有所表達(dá)，并且免疫組化檢測(cè)其在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá);
　　2.在SW620過(guò)表達(dá)CRIP1和HCT116敲低CRIP1后，CCK8及EDU增殖實(shí)驗(yàn)均可證明CRIP1可促進(jìn)入結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖;流式細(xì)胞儀檢測(cè)及Tunel凋亡細(xì)胞

6、成像實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRIP1可抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，但對(duì)細(xì)胞周期影響不明顯;
　　3.免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明CRIP1與凋亡相關(guān)蛋白呈負(fù)調(diào)控關(guān)系，尤其是與Fas，但酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)證明CRIP1對(duì)FasL的影響不明顯;流式細(xì)胞儀及細(xì)胞成像法進(jìn)行恢復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證也同時(shí)證明了CRIP1對(duì)Fas的負(fù)調(diào)控從而抑制凋亡通路;
　　4.熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)證明CRIP1在mRNA水平上對(duì)Fas無(wú)明顯影響，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(CO-IP)卻

7、證明兩者有蛋白間相互作用且CRIP1通過(guò)泛素化降解Fas。
　　結(jié)論:
　　1.CRIP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中mRNA水平及蛋白水平均有所表達(dá)，且在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá);
　　2.CRIP1促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖;
　　3.CRIP1通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖;
　　4.CRIP1通過(guò)抑制Fas/FasL細(xì)胞凋亡途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡;
　　5.CRIP1通過(guò)泛素化降解Fas抑制Fas/FasL細(xì)胞凋