膽汁酸核受體FXR調(diào)控結直腸癌Wnt-β-catenin信號通路的機制研究.pdf

1、本文從以下幾個部分闡述了膽汁酸核受體FXR調(diào)控結直腸癌Wnt/β--catenin信號通路的機制研究。
　　第一部分 膽汁酸核受體FXR調(diào)控結直腸癌細胞Wnt/β-catenin信號通路的機制研究
　　目的:探討膽汁酸核受體FXR對結直腸癌細胞Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用及其機制。
　　方法:選用人結腸癌細胞株Caco-2、HCT-116、HT-29，采用Western blot檢測FXR及β-cate

2、nin的表達水平。siRNA沉默F(xiàn)XR后，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測β-catenin轉(zhuǎn)錄活性的變化，采用Western blot檢測β-catenin蛋白水平的表達變化。分別經(jīng)不同濃度FXR激動劑GW4064(1、3、5umol/L)干預12、24、36和48h，采用噻唑蘭試驗(MTT)測細胞增殖能力的變化。GW4064干預后，采用凝膠遷移實驗(EMSA)檢測NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性;采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性

3、變化，采用EMSA檢測β-catenin/TCF4復合物水平，Western blot檢測GW4064干預后細胞核內(nèi)β-catenin及總蛋白水平的變化，并采用qRT-PCR檢測β-catenin mRNA水平的表達變化。在GW4064干預下，予以NF-κB信號通路的激動劑(LPS)，重復上述實驗檢測對其影響。
　　結果:(1) Caco-2、HT-29高表達FXR，HCT-116表達程度較其低，F(xiàn)XR同β-catenin的表達在

4、不同細胞系中不一致;(2)在HT-29、Caco-2、HCT-116細胞中沉默F(xiàn)XR可上調(diào)Wnt通路(HT-29細胞:1.47±0.14 vs1.04±0.03，Caco-2細胞:5.18±0.41vs3.63±0.32，HCT-116細胞:4.66±0.43 vs3.22±0.26，p＜0.05)，不影響β-catenin蛋白表達;(3) GW4064干預HT-29、Caco-2、HCT-116細胞可顯著抑制細胞增殖(HT-29細胞3

5、uM24h:0.48±0.03 vs0.74±0.03，Caco-2細胞3uM24h:0.31±0.01 vs0.59±0.05, HCT-116細胞5uM24h:0.18±0.01 vs0.43±0.04, p＜0.05),其抑制作用隨濃度的增加和作用時間逐漸增強;(4)在HT-29、Caco-2、HCT-116細胞中，GW4064促進NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性;(5)在HT-29、Caco-2、HCT-116細胞中，GW4064能通過增加

6、β-catenin/TCF4復合物，上調(diào)Wnt通路（HT-29細胞:1.14±0.02 vs0.87±0.04，Caco-2細胞:3.30±0.14 vs2.11±0.10，HCT-116細胞:2.89±0.26 vs1.28±0.07，p＜0.05)，但不影響β-cateninmRNA和蛋白表達。(6)在HT-29、Caco-2、HCT-116細胞中，在LPS作用下，GW4064能通過增加β-catenin/TCF4復合物，上調(diào)Wnt

7、通路（HT-29細胞:1.15±0.03 vs0.99±0.03，Caco-2細胞:5.24±0.04 vs3.91±0.03，HCT-116細胞:8.05±0.22 vs3.70±0.05，p＜0.05)，與GW4064直接作用結果一致。
　　結論:FXR缺失導致Wnt/β-catenin信號通路上調(diào)，促進腫瘤發(fā)生;FXR激動劑GW4064可顯著抑制腫瘤細胞的增殖能力，但對Wnt/β-catenin信號通路具有上調(diào)作用。FXR與

8、Wnt途徑密切相關，不同F(xiàn)XR激活狀態(tài)對Wnt通路的調(diào)控作用有所不同。
　　第二部分 益生菌在結腸炎相關結直腸癌小鼠模型中對膽汁酸核受體FXR的調(diào)節(jié)作用
　　目的:在氧化偶氮甲烷(AOM)聯(lián)合葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的潰瘍性結腸炎(UC)癌變動物模型中，探討益生菌干預后對膽汁酸核受體FXR及其下游通路的調(diào)控。
　　方法:C57BL/6小鼠隨機分為4組，第1-3組建立AOM/DSS誘導的UC癌變小鼠模型，腹腔注射AOM

9、12.5mg/kg，1周后給予含2.5％DSS的飲用水，連續(xù)5天，之后換成普通飲用水，12周后建模完成。第1組為布拉氏酵母菌組，給予布拉氏酵母菌1.5g/kg/d每日灌胃;第2組為VSL＃3組，給予VSL#31.5g/kg/d每日灌胃;第3組為模型對照組，不給予任何干預;第4組為空白對照組。12周后處死小鼠，統(tǒng)計瘤負荷(TL)，進行病理學評估，采用qRT-PCR檢測小鼠結腸組織Nr1h4、Fgf15mRNA的表達變化，采用免疫組化檢測小

10、鼠結腸組織FXR、SHP/NR0B2、FGF15的表達情況，采用ELISA檢測小鼠血清FGF15分泌的情況。
　　結果:(1)各組的瘤負荷顯示:布拉氏酵母菌組（n=19，TL=0.20±0.07cm）、VSL#3組(n=20，TL=0.25±0.07cm)較模型對照組（n=19，TL=0.97±0.19cm）均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。(2)結腸上皮細胞Nr1h4、Fgf15 mRNA表達量:模型對照組較空白對照

11、組顯著降低(n=6，Nr1h40.53±0.08 vs1.10±0.09; Fgf150.80±0.16 vs1.42±0.14)，布拉氏酵母菌組（n=6，Nr1h41.29±0.15，F(xiàn)gf151.87±0.26）、VSL#3組（n=6，Nr1h41.31±0.21，F(xiàn)gf152.16±0.34）較模型對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。(3)結腸上皮細胞免疫組化FXR表達量:模型對照組較空白對照組顯著降低，布拉氏酵母菌組、

12、VSL#3組較模型對照組升高;SHP、FGF15表達量，模型對照組較空白對照組顯著降低，布拉氏酵母菌組、VSL#3組無明顯變化。(4)小鼠血清FGF15 ELISA結果顯示:模型對照組較空白對照組顯著降低(n=6，0.51±0.33 vs2.87±0.54)，布拉氏酵母菌組（n=10，2.03±0.46）較模型對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，VSL#3組（n=10，0.58±0.21）無明顯變化。
　　結論:益生菌可