血漿microRNA用于結(jié)直腸癌診斷的研究及miR-95促進(jìn)結(jié)直腸癌生長(zhǎng)的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分血漿循環(huán)miRNA分析用于結(jié)直腸癌診斷的研究
　　研究目的：
　　微小RNA(miRNA)是一類潛力巨大的腫瘤診斷標(biāo)志物，但血循環(huán)miRNA在腫瘤診斷中的價(jià)值尚不清楚，本研究初步評(píng)估了血漿循環(huán)miRNA分析在結(jié)直腸癌(CRC)分子診斷中的價(jià)值，為尋找新的CRC無(wú)創(chuàng)性早期診斷方法提供新的思路。
　　研究方法：
　　以14例CRC和10例正常對(duì)照者血漿總RNA為材料，采用Agilent miRNA表達(dá)譜芯片進(jìn)

2、行miRNA表達(dá)譜分析，篩選在CRC患者血漿中上調(diào)的miRNA分子。用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)技術(shù)在新的樣本組中進(jìn)行進(jìn)一步篩選和驗(yàn)證。采用ROC曲線分析血漿miRNA對(duì)CRC及進(jìn)展期腺瘤的診斷價(jià)值;并選擇20例CRC患者，分別收集手術(shù)前后的血漿標(biāo)本，分析手術(shù)前后血漿差異表達(dá)miRNA的變化。
　　研究結(jié)果：
　　血漿miRNA表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，在CRC血漿中上調(diào)的靶點(diǎn)有26個(gè)，下調(diào)的靶點(diǎn)29個(gè)。運(yùn)用qR

3、T-PCR技術(shù)（以miR-16為內(nèi)參照）對(duì)32個(gè)候選靶點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，CRC組及進(jìn)展期腺瘤組血漿miR-29a和miR-92a水平均顯著上調(diào)(P＜0.001)。ROC曲線分析顯示，血漿miR-29a和miR-92a診斷CRC的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.844和0.838，診斷進(jìn)展期腺瘤的AUC分別為0.769和0.749。聯(lián)合這兩個(gè)靶點(diǎn)診斷CRC的AUC為0.883，敏感度和特異度分別為83.0％和84.7

4、％，診斷進(jìn)展期腺瘤的AUC為0.773，敏感度和特異度分別為73.0％和79.7％。此外，還發(fā)現(xiàn)手術(shù)后CRC患者血漿miR-29a和miR-92a含量均顯著下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　血漿miR-29a和miR-92a是潛在的CRC診斷分子標(biāo)志物;血漿miRNA分析有可能發(fā)展成為一種新的非侵入性CRC早期診斷方法。
　　第二部分miR-95促進(jìn)結(jié)直腸癌生長(zhǎng)的研究
　　研究目的：
　　研究miR-

5、95對(duì)CRC細(xì)胞惡性表型的影響;并分析miR-95和CRC患者預(yù)后及腫瘤臨床病理表型的關(guān)系，評(píng)估m(xù)iR-95表達(dá)在CRC診斷、預(yù)后判斷中的應(yīng)用價(jià)值。
　　研究方法：
　　采用Agilent miRNA表達(dá)譜芯片分析10對(duì)CRC組織（與癌旁正常組織比較）的miRNA表達(dá)譜。選擇在CRC中上調(diào)的miR-95進(jìn)行分子機(jī)制研究，利用慢病毒載體構(gòu)建了miR-95的穩(wěn)定細(xì)胞株，運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)、生長(zhǎng)曲線分析、克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、裸鼠成瘤

6、等技術(shù)分析miR-95對(duì)CRC腫瘤生長(zhǎng)的影響。同時(shí)使用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)臨床CRC標(biāo)本中miR-95的表達(dá)，分析miR-95和CRC患者預(yù)后及腫瘤臨床病理表型的關(guān)系。
　　研究結(jié)果：
　　miRNA表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，CRC組織的miRNA表達(dá)譜式與對(duì)應(yīng)正常粘膜組織相比存在顯著差異，共篩選出49個(gè)差異表達(dá)基因，其中miR-95等26個(gè)靶點(diǎn)在CRC中顯著上調(diào)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤等實(shí)驗(yàn)均表明miR-95高表

7、達(dá)可顯著促進(jìn)CRC細(xì)胞（HCT-116和LoVo）的生長(zhǎng)，抑制其凋亡。而利用siRNA抑制miR-95表達(dá)后，HCT-8細(xì)胞的生長(zhǎng)速率顯著下調(diào)。運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)一步分析了87例CRC組織中miR-95的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-95確實(shí)在腫瘤組織中顯著上調(diào)（P＜0.0001），但與腫瘤分期、分化、大小及總生存均無(wú)顯著相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　與正常結(jié)直腸組織相比，CRC組織的miRNA表達(dá)譜存在顯著差異;miR-95能夠促進(jìn)

8、CRC的生長(zhǎng)，是潛在的CRC癌基因。
　　第三部分miR-95靶基因的篩選及鑒定
　　研究目的：
　　篩選并鑒定miR-95的靶基因，并探討miR-95如何通過(guò)其靶基因參與CRC的發(fā)生發(fā)展。
　　研究方法：
　　采用基因芯片技術(shù)分析miR-95穩(wěn)定細(xì)胞株的表達(dá)譜與對(duì)照細(xì)胞的差異，同時(shí)運(yùn)用miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan和miRanda對(duì)miR-95的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)。根據(jù)芯片分析及軟件預(yù)

9、測(cè)篩選出miR-95的候選靶基因，克隆其3'-UTR，運(yùn)用熒光素酶試驗(yàn)初步分析miR-95對(duì)這些基因的表達(dá)是否具有調(diào)控作用，對(duì)miR-95的潛在靶基因做進(jìn)一步篩選。最后，運(yùn)用qRT-PCR和Western blot技術(shù)驗(yàn)證候選靶基因在CRC細(xì)胞中的表達(dá)情況，用IHC技術(shù)檢測(cè)靶基因在臨床CRC標(biāo)本中的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果：
　　根據(jù)軟件預(yù)測(cè)及基因芯片預(yù)測(cè)，篩選出9個(gè)候選靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。熒光素酶試驗(yàn)顯示，SNX1、PTPN3