銀杏不同樹齡維管形成層活動的轉錄調控研究.pdf

1、古樹的壽命可長達上百年甚至上千年，是不可再生的重要自然資源，是活的化石，在科學研究中具有極其重要的地位。目前古樹壽命分子調控機理的研究極少，這是由于古樹的分布區(qū)域差異大、受環(huán)境的破壞以及實驗材料不容易獲得等原因。樹木的維管形成層(vascular cambium)具有不斷分裂分化的能力，又被稱為“形成層干細胞”，在古樹的生長過程中，通過不斷的分裂分化維持樹木的繼續(xù)生長與增粗，不僅能準確反應古樹的樹齡，且因其位置及材質的穩(wěn)定性使得取材方便

2、。銀杏（Ginkgo bilobaL.）是現存最古老的裸子植物之一，在中國分布許多百年以上甚至千年的古銀杏。本研究利用第二代高通量測序技術對雌株銀杏不同樹齡維管形成層進行轉錄組測序分析，并結合細胞學、分子生物學和生物信息學等實驗技術對銀杏主干維管形成層進行研究，其主要研究結果如下:
　　1.對不同樹齡銀杏樹生長情況、葉片、結實以及種子萌發(fā)情況進行了評估和測定工作。發(fā)現樹齡分別為20年，200年和600年左右的銀杏樹上沒有明顯的機械

3、損傷，病蟲害等現象。三組樹齡銀杏樹結實正常，并且種子萌發(fā)率正常。
　　2.利用半薄切片技術，對包含有韌皮部、形成層和木質部的包埋樣品進行切片觀察，發(fā)現樹齡為20年的銀杏形成層細胞層數有7至9層，而古樹組200年和600年的銀杏維管形成層細胞層數明顯減少。
　　3.通過Illumina HiSeqTM2500測序平臺對三組不同樹齡銀杏形成層進行轉錄組測序，共獲得三組樣品Clean read分別為54，580，856(52，07

4、0，908)，55，414，956(53，212，132)，54，600，518(52，615，596)條，Q20％在98％之上。之后，通過Trinity軟件組裝，共獲得97，303條unigenes，平均長度為1500bp，N50為2，476bp。
　　4.將97，303條序列通過BLASTx比對，發(fā)現共有63，912條unigenes被注釋在6大數據庫。其中，在NR數據庫中注釋到62，266條，占到總unigenes數量的63

5、.99％。此外，COG功能注釋發(fā)現有25類群，其中轉錄本、信號傳導機制、細胞周期調控和細胞分裂功能類群較多。
　　5.經差異基因表達篩選，我們發(fā)現20年與200年間差異基因有2，572條，20年與600年間差異基因有1，312條，以及200年與600年間差異基因有891條。通過與20年相比，古樹組差異基因都明顯GO富集在細胞成分的胞外區(qū)，分子功能下的氧化還原酶活性，以及生物學過程中的次生細胞壁生物合成和木質素代謝過程。此外，通過K

6、EGG富集發(fā)現，20年與200年，20年與600年以及200年與600年之間的差異基因KO富集的前兩個通路都是代謝通路和次生代謝合成。
　　6.在形成層區(qū)域其自身細胞分裂能力對于維管組織的生長是非常重要。因而，我們對被注釋為細胞分裂以及擴增相關基因進行分析，發(fā)現有21個候選基因，在20年中高表達，而在古樹200年和600年中低表達。此外，我們也發(fā)現與細胞壁生物合成相關的基因在20年中高表達，而在古樹中表達量下降。
　　7.我

7、們對被注釋在植物激素信號轉導中基因分析，發(fā)現有大量基因是響應生長素，赤霉素，細胞分裂素，脫落酸，乙烯和油菜素內酉旨，并且它們在不同樹齡間有著不同的表達模式。其中被注釋與生長素和細胞分裂素相關的基因高表在20年樹齡中，而低表達在古樹組中。而脫落酸受體PYR/PYL基因以及乙烯生物合成相關基因在古樹組高表達而低表達在20年銀杏形成層中。
　　8.在銀杏維管形成層中預測到2，814個轉錄因子，分屬于59個轉錄因子家族。其中MYB(12.

8、40％)，AP2-EREBP(8.02％)和MYB-related(7.74％)轉錄因子家族成員最多。此外，通過RPKM＞0.3值篩選轉錄因子，發(fā)現每個轉錄因子家族基因分布在20年、200年和600年都在30％左右。此外，我們進一步研究了差異轉錄因子在三組不同樹齡銀杏維管形成層中表達情況，如注釋為GAMYB，MADS，bHLH，TCP和zinc transporter2-1ike等轉錄因子。其中與20年對比，總體上古樹組200年和600

9、年更多是呈下降趨勢。
　　9.應用實時熒光定量PCR方法驗證與細胞分裂分化、細胞壁生物合成以及植物激素等差異基因。結果發(fā)現RNA-Seq和qRT-PCR表達趨勢上一致并且其差異倍數一致性也較好，表明高通量測序結果是可靠的。這些結果進一步闡明與細胞分裂分化，細胞壁生物合成以及植物激素相關基因在不同樹齡的銀杏維管形成層中的表達量是不同的。
　　綜上所述，本研究通過RNA-Seq結合細胞學，分子生物學和生物信息學等技術研究銀杏不同