肺炎克雷伯菌轉錄調控子CRP對allS的調控研究.pdf

1、目的：探究肺炎克雷伯菌cAMP受體蛋白(cAMP receptor protein， CRP)對基因allS的調控關系及機制。
　　方法：首先，PCR擴增allS的啟動子區(qū)序列，擴增產物進行純化，酶切連接入placZ15質粒，構建得到重組質粒，將重組質粒分別轉入肺炎克雷伯菌CCW01（缺失lacZ基因）和CCW01:△crp（缺失crp基因）中。通過測定CCW01和CCW01:△crp的β-半乳糖苷酶活性，并用統(tǒng)計學方法分析數值結

2、果，確定調控子CRP對allS基因的調控關系。運用RT-PCR逆轉錄肺炎克雷伯野生株和突變株△crp RNA為cDNA后比較allS基因在野生株和突變株△crp中的表達量來進一步驗證 CRP對allS的調控關系。表達純化出有活性的His-CRP蛋白，然后經PCR擴增allS啟動子區(qū)的DNA序列，通過凝膠阻滯實驗確定CRP是否能結合到allS的啟動子區(qū)，通過應用DNaseⅠ足跡實驗鑒定CRP在allS啟動子區(qū)的具體結合位點。
　　結

3、果：lacZ報告基因融合實驗顯示CRP對allS具有正調控作用。實時定量RT-PCR顯示突變株△crp中allS基因表達量明顯低于野生株，進而驗證了LacZ報告基因融合實驗所得結果的正確性。凝膠阻滯實驗和DNaseⅠ足跡實驗進一步表明CRP能直接結合到allS啟動子區(qū)的-94到-60之間的堿基序列上（轉錄起始位點為+1）。
　　結論：CRP調控子可以結合到allS的啟動子區(qū)并促進allS基因的轉錄。本研究首次探索了肺炎克雷伯菌轉錄