Stathmin基因過表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

1、Stathmin基因是一個與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的癌基因，研究表明，該基因在大多數(shù)的惡性腫瘤中均呈過表達狀態(tài)，阻斷它的表達可有效的逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤的生物學(xué)表型。然而目前，關(guān)于stathmin基因過表達的調(diào)控機理卻尚未完全闡明，我們對stathmin基因5’端的啟動子區(qū)及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子進行了較全面的分析研究，以期最終揭示惡性腫瘤細胞中stathmin基因過表達的調(diào)控機理，希望為發(fā)掘惡性腫瘤診治新靶點奠定堅實的基礎(chǔ)。
　　目的：

2、為了研究stathmin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，首先從基因組DNA中擴增stathmin基因啟動子序列，并且對其活性進行檢測，然后用PCR的方法獲得不同截短型的stathmin基因啟動子，確定stathmin基因啟動子核心區(qū)，接著對核心啟動子序列進行分析，預(yù)測對其有調(diào)控作用的一些重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，最后研究這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對stathmin基因啟動子的調(diào)控作用，并探討它們在惡性腫瘤細胞中對stathmin基因過表達的作用機制，以期從轉(zhuǎn)錄調(diào)控的角

3、度揭示stathmin基因過表達的機理。
　　方法：（1）首先設(shè)計合成擴增全長stathmin基因啟動子序列的引物，以A549細胞基因組DNA為模板，通過PCR的方法，擴增stathmin基因啟動子；然后，我們將全長的stathmin基因啟動子連入啟動子活性檢測的專用載體pGL3-Basic/LUC和pGL3-Basic/EGFP中，命名為pGL3-Basic/LUC/stap和pGL3-Basic/EGFP/stap，將重組質(zhì)粒

4、分別轉(zhuǎn)染293細胞和A549細胞，檢測報告基因熒光素酶和綠色熒光蛋白的表達情況，驗證stathmin基因啟動子的活性。（2）設(shè)計合成擴增不同截短型stathmin基因啟動子的引物，通過PCR的方法擴增相應(yīng)的啟動子片段，并且連入啟動子活性檢測專用載體，通過報告基因的表達情況檢測啟動子的活性變化。（3）用啟動子分析軟件對核心啟動子序列進行分析，發(fā)現(xiàn)在核心啟動子上存在E2F1、NF-Y、Sp1及Egr1的結(jié)合位點，針對這些結(jié)合位點，設(shè)計合成含

5、有預(yù)期突變位點的引物，然后以待突變的質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增反應(yīng)，構(gòu)建含有預(yù)期突變位點的報告基因重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細胞，檢測報告基因的表達變化；接著進行染色質(zhì)免疫共沉淀試驗，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子E2F1、NF-Y、Sp1及Egr1特異性抗體的作用，得到與它們相結(jié)合的DNA片段，然后通過PCR擴增，驗證這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在細胞內(nèi)是否可以與結(jié)合位點直接結(jié)合。（4）在過表達和干涉實驗中，構(gòu)建E2F1、NF-Y、Sp1及Egr1全長的真核表達載體和干涉

6、載體，轉(zhuǎn)染A549細胞，RT-PCR和WesternBlot檢測相應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及stathmin基因的表達情況。（5）通過不同方法（PMA、UV、DOX等）上調(diào)Egr1的表達，然后從mRNA和蛋白水平檢測stathmin的表達情況；構(gòu)建Egr1位點突變的全長stathmin基因啟動子報告基因載體，檢測啟動子活性變化；通過染色質(zhì)免疫共沉淀和凝膠遷移試驗檢測Egr1與stathmin基因啟動子的結(jié)合情況；通過不通的方式（UV、DOX及p5

7、3真核表達載體等）作用于A549細胞和A549-KE細胞（轉(zhuǎn)染了Egr1干涉載體），通過熒光素酶報告基因系統(tǒng)和WesternBlot檢測stathmin基因啟動子的活性及表達的改變。
　　結(jié)果：（1）獲得的stathmin基因啟動子經(jīng)測序和雙酶切鑒定證實所擴增序列與GenBank中報道序列一致，將pGL3-Basic/LUC/stap和pGL3-Basic/EGFP/stap載體分別轉(zhuǎn)染293細胞和A549細胞，檢測報告基因的表達

8、，結(jié)果表明：stathmin基因啟動子可以調(diào)控報告基因的表達，并且它的啟動子活性明顯強于另一個腫瘤相關(guān)啟動子survivin基因啟動子。（2）運用PCR的方法獲得了不同截短型的啟動子片段分別為：1500bp、1000bp、600bp、400bp及200bp，通過酶切及測序鑒定所獲得的不同長度的啟動子序列正確，同時對它們的調(diào)控活性檢測結(jié)果表明，報告基因均顯示400bp的啟動子片段活性最強。（3）位點突變試驗中，成功構(gòu)建了含有預(yù)期突變位點的

9、重組報告基因質(zhì)粒，通過報告基因的檢測，發(fā)現(xiàn)E2F1、NF-Y、Sp1結(jié)合位點突變以后，核心啟動子的活性均有或多或少的減弱，而Egr1結(jié)合位點突變以后，核心啟動子的活性明顯增強；染色質(zhì)免疫共沉淀試驗證實了這四個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子都可以和stathmin基因核心啟動子上的預(yù)測位點直接結(jié)合。（4）在過表達試驗中，E2F1、NF-Y、Sp1的增加可以不同程度的上調(diào)stathmin基因的表達，而Egr1表達的增加則可明顯下調(diào)stathmin基因表達水平

10、；干涉試驗中，E2F1、NF-Y、Sp1的表達降低可以不同程度的下調(diào)stathmin基因的表達，而Egr1表達的降低則可明顯上調(diào)stathmin基因的表達水平。（5）增加細胞內(nèi)Egr1的表達可以從mRNA和蛋白水平減低stathmin的表達；Egr1可以與stathmin基因啟動子上的Egr1位點直接結(jié)合，調(diào)控stathmin基因啟動子的活性；在A549細胞中，通過上調(diào)p53的表達，可以誘導(dǎo)Egr1的表達增加，使得stathmin基因的

11、表達水平下降；但是在A549-KE細胞中，上調(diào)的p53并沒有改變Egr1和stathmin基因的表達水平。
　　結(jié)論：（1）獲得了全長的stathmin基因啟動子，并且經(jīng)測序鑒定，與GeneBank中報道的序列一致；而且通過對該啟動子活性的檢測發(fā)現(xiàn)，stathmin基因啟動子的活性明顯強于另一個與腫瘤相關(guān)的survivin基因啟動子。（2）獲得了正確的不同截短型的啟動子片段，并且確定了400bp的stathmin基因啟動子核心區(qū)域

12、。（3）轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子E2F1、NF-Y、Sp1及Egr1可以通過作用于stathmin基因核心啟動子上的相應(yīng)結(jié)合位點，調(diào)控核心啟動子的活性。（4）E2F1、NF-Y、Sp1及Egr1均能夠調(diào)控stathmin表達，其中E2F1、NF-Y、Sp1可以不同程度的上調(diào)它的表達，而Egr1則能夠下調(diào)stathmin的表達，并且Egr1的調(diào)控作用最明顯。（5）轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Egr1可以從轉(zhuǎn)錄水平抑制stathmin表達，p53能夠通過Egr1介導(dǎo)對