針灸提高大鼠對疫苗的免疫效應(yīng)及延緩衰老的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:檢測“雙固一通”電針法延緩D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型大鼠的免疫衰老(實(shí)驗(yàn)一);探討“雙固一通”針灸法對不同濃度百白破疫苗免疫大鼠增強(qiáng)其疫苗免疫效應(yīng)的作用,摸索針灸提高疫苗免疫效應(yīng)的最佳疫苗濃度(實(shí)驗(yàn)二);檢測D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型大鼠衰老相關(guān)指標(biāo)的改變,鑒定免疫衰老模型構(gòu)建成功(實(shí)驗(yàn)三);將百白破疫苗免疫衰老模型及正常大鼠,采用“雙固一通”針灸法處理,探討針灸是否能提高大鼠對疫苗的免疫應(yīng)答效應(yīng),發(fā)揮疫苗佐劑的作用及延緩免疫衰老的效應(yīng)(

2、實(shí)驗(yàn)四)。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)一:雄性SPF級(jí)SD大鼠40只,隨機(jī)取30只大鼠經(jīng)皮下注射D-半乳糖42d制作衰老大鼠模型,剩余10只為正常對照組。造模結(jié)束后模型組再隨機(jī)分為雙固一通組(“關(guān)元”、“后三里”穴接電針,“百會(huì)”穴毫針針刺)、針刺對照組(“委中”、“水分”穴接電針,“印堂”穴毫針針刺)、衰老模型組,每組10只大鼠。經(jīng)3周治療后處死動(dòng)物檢測脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、流式細(xì)胞法檢測CD8+T細(xì)胞占T細(xì)胞的百分率及C

3、D8+CD28-T占CD8+T細(xì)胞的百分率。
　　 實(shí)驗(yàn)二:雌性SPF級(jí)Wistar大鼠48只,隨機(jī)分組為六組:1/10疫苗免疫針灸組、1/10疫苗免疫對照組、1/20疫苗免疫針灸組、1/20疫苗免疫對照組、1/40疫苗免疫針灸組、1/40疫苗免疫對照組。每組注射相應(yīng)濃度的百白破疫苗,針灸組電針刺激大鼠“后三里”、“百會(huì)”、“關(guān)元”穴,并施以艾灸處理3周,第5周取材,心臟采血分離血清,用Vero細(xì)胞法測定白喉抗毒素的效價(jià);MTS

4、比色法檢測脾細(xì)胞特異性增殖能力;流式細(xì)胞法檢測CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值;RT-PCR檢測脾細(xì)胞熱休克蛋白70(HSP70)mRNA的相對表達(dá)量(同GAPDH比較)。
　　 實(shí)驗(yàn)三:雌性SPF級(jí)Wistar大鼠20只,隨機(jī)取10只大鼠皮下注射D-半乳糖42d制作衰老大鼠模型,剩余10只為正常對照組。造模結(jié)束后,進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物,檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)的活性及甘油三脂(TG),膽固醇(CHOL)

5、的含量,RT-PCR檢測脾細(xì)胞HSP70mRNA的相對表達(dá)量。
　　 實(shí)驗(yàn)四:雌性SPF級(jí)Wistar大鼠40只,隨機(jī)分成4組:模型免疫針灸組、模型免疫對照組、正常免疫針灸組、正常免疫對照組。模型免疫組用D-半乳糖頸背部皮下注射6周,構(gòu)建衰老大鼠模型。正常免疫組注射等量生理鹽水,第7周所有大鼠注射百白破疫苗,電針刺激大鼠“后三里”、“百會(huì)”、“關(guān)元”穴,并施以艾灸處理3周,針灸治療結(jié)束后再繼續(xù)喂養(yǎng)2周,至第12周處死所有大鼠,心

6、臟采血,分離血清檢測SOD活性、血脂和蛋白含量,用Vero細(xì)胞法測定白喉抗毒素的效價(jià);流式細(xì)胞法檢測CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值;RT-PCR檢測脾細(xì)胞HSP70mRNA的相對表達(dá)量。
　　 結(jié)果:
　　 實(shí)驗(yàn)一:衰老模型組大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)低于正常對照組(P＜0.05);C08+CD28-T細(xì)胞占C08+T細(xì)胞百分率衰老模型組明顯高于正常對照組(P＜0.01);CD8+T細(xì)胞占T細(xì)胞百分率衰老模型組亦明顯高于

7、正常對照組(P＜0.01)。雙固一通組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)較衰老模型組升高(P＜0.05),而CD8+CD28-T細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞百分率顯著降低(P＜0.01);針刺對照組CD8+CD28-T細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞的百分率較衰老模型組亦降低(P＜0.01);但雙固一通組比針刺對照組的CD8+CD28-T細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞比值降低得更為顯著(P＜0.05)。
　　 實(shí)驗(yàn)二:1/20疫苗免疫針灸組的抗體效價(jià)明顯高于1/20疫苗免疫

8、對照組(P＜0.01);1/10疫苗免疫針灸組和1/10疫苗免疫對照組抗體效價(jià)均高,無明顯差異;而1/40疫苗免疫針灸組和1/40疫苗免疫對照組抗體效價(jià)亦無明顯差異。脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明疫苗本身對細(xì)胞有毒性,不適宜做特異性增殖實(shí)驗(yàn),流式細(xì)胞法檢測1/20疫苗免疫針灸組CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值較其對照組略有增加(P＞0.05);RT-PCR結(jié)果顯示1/20疫苗針灸組脾細(xì)胞HSP70mRNA的相對表達(dá)量較其對照組略有升高(P＞0.0

9、5)。
　　 實(shí)驗(yàn)三:衰老模型組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)(空間探索實(shí)驗(yàn))經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)(P＜0.05)和有效區(qū)停留時(shí)間(P＜0.01)明顯少于正常對照組;血清SOD活性明顯低于正常對照組(P＜0.01),TG和CHOL含量高于正常對照組(P＜0.05);脾細(xì)胞HSP70mRNA相對表達(dá)量低于正常對照組(P＜0.05)。
　　 實(shí)驗(yàn)四:模型免疫對照組較正常免疫對照組的SOD活性明顯降低(P＜0.01);TG和CHOL的含量升高(P＜0

10、.05);總蛋白(TP)和球蛋白(GLB)含量降低(P＜0.05);抗體效價(jià)明顯降低(P＜0.01);CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值明顯降低(P＜0.01);脾細(xì)胞HSP70 mRNA的相對表達(dá)量明顯降低(P＜0.01)。模型免疫針灸組較模型免疫對照組的SOD活性升高(P＜0.05);TG和CHOL含量降低(P＜0.05);TP和GLB含量升高(P＜0.05);抗體效價(jià)明顯升高(P＜0.01);CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值升高

11、(P＜0.05);脾細(xì)胞HSP70 mRNA的相對表達(dá)量升高(P＜0.05)。正常免疫針灸組較正常免疫對照組的TG和CHOL含量降低(P＜0.05);TP和GLB含量升高(P＜0.05);抗體效價(jià)升高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 實(shí)驗(yàn)一:電針可通過提高胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群的比例,延緩D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型大鼠的免疫衰老。
　　 實(shí)驗(yàn)二:針灸能提高大鼠對百白破疫苗的免疫效應(yīng),且最佳疫苗免疫濃

12、度為1/20倍,具有作為新型疫苗佐劑的潛能。
　　 實(shí)驗(yàn)三:D-半乳糖能降低大鼠認(rèn)知水平,增高血脂,降低氧化應(yīng)激水平及應(yīng)激蛋白HSP70mRNA表達(dá),是一種構(gòu)建衰老動(dòng)物模型的較好方法。
　　 實(shí)驗(yàn)四:針灸能改善衰老大鼠的衰老相關(guān)生化指標(biāo),且能提高衰老機(jī)體對百白破疫苗的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答效應(yīng),其機(jī)制可能與通過增加內(nèi)源性佐劑物質(zhì)HSP70mRNA表達(dá)有關(guān)。
　　 綜上所述,針灸能有效延緩免疫衰老,且能通過誘生內(nèi)源