益婦寧延緩大鼠卵巢衰老的藥效與機(jī)制研究.pdf

1、卵巢衰老是從生殖成熟以后才開始或者加速的。它是一個(gè)具有普遍性、累積性、漸進(jìn)性、內(nèi)生性的生命的過程，是雌性生物的共同特征。圍絕經(jīng)期婦女最突出的變化是卵巢老化，重量減輕，卵巢體積減小，其表面皺縮不平及質(zhì)地變硬，卵泡用盡或剩余卵泡對促性腺激素的刺激不敏感，合成與分泌性激素減少。目前，卵巢衰老有關(guān)的病因機(jī)制尚不完全明確，遺傳因素、某些外來因素（如放療、化療、毒素、卵巢外傷或手術(shù)）、體內(nèi)的內(nèi)分泌因子、生長因子、細(xì)胞因子等因素都對卵巢衰老產(chǎn)生影響。

2、卵巢的老化不但與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)變化有關(guān)，且與其內(nèi)在老化機(jī)制，步入圍絕經(jīng)期，卵巢會自主性失去器官功能，正常卵泡閉鎖過程加快，或卵子被各種機(jī)制破壞，導(dǎo)致卵泡的耗竭，卵母細(xì)胞萎縮，卵巢顆粒細(xì)胞凋亡等有關(guān)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)用于治療卵巢衰老的藥物主要有激素補(bǔ)充治療、促排卵治療、免疫抑制劑及贈卵治療等，但均沒有令人滿意的療效;激素替代療法（HRT）由于療程長，副作用大，且對乳房及雌激素靶器官存在潛在的危險(xiǎn)，使患者體重增加，心里承受壓力增大，恐懼致癌

3、，等等。因此，越來越多的學(xué)者把目光轉(zhuǎn)移至中醫(yī)藥對此病的研究、預(yù)防及治療上。
　　 益婦寧(YFN）為治療婦女圍絕經(jīng)期綜合癥的中藥復(fù)方，該方由君藥哈蟆油和臣藥莪術(shù)組成，具有補(bǔ)腎益精，調(diào)和氣血，消積祛濁之功效。已有動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明該方其具有抗氧化，抗衰老作用，能升高去卵巢模型大鼠血清E2水平，升高子宮、腎上腺指數(shù)，同時(shí)還可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，下丘腦、垂體和血漿β-內(nèi)啡肽、5-羥色胺、去甲腎上腺素和多巴胺含量。也就是說，YFN在作用

4、于摘除卵巢的動物時(shí)，能通過改善下丘腦-垂體-性腺軸的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，調(diào)節(jié)外周血激素水平，并且明顯改善臨床婦女圍絕經(jīng)期癥狀，那么YFN是否直接影響卵巢功能尚無證據(jù)。
　　 目的：
　　 YFN為哈蟆油的復(fù)方，已有的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及動物體內(nèi)機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)表明哈蟆油能促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞雌二醇的分泌及細(xì)胞增殖作用，同時(shí)哈蟆油還能改善卵巢衰老的病理狀態(tài)及下調(diào)細(xì)胞周期負(fù)性因子，因此，前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)為YFN治療卵巢衰老提供了確切的實(shí)驗(yàn)依據(jù)

5、。但目前對該方的研究尚缺乏有效成分的控制和該方對卵巢衰老作用的整體動物藥效及機(jī)制的驗(yàn)證，所以本課題進(jìn)行有效成分初步研究及整體藥效研究，并結(jié)合前期細(xì)胞研究結(jié)果和動物藥理研究結(jié)果進(jìn)一步探討其延緩大鼠卵巢衰老的作用機(jī)制，為本方治療圍絕經(jīng)期卵巢衰老提供宏觀水平的應(yīng)用依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.益婦寧有效成分的初步研究
　　 采用考馬斯亮藍(lán)法及紫外分光光度法對測定YFN及君藥哈蟆油中蛋白質(zhì)及氨基酸含量。采用高效液相色譜

6、法檢測YFN和哈蟆油中有效成分雌二醇，1-甲基海因，亞油酸，維生素E及益婦寧中莪術(shù)醇含量。
　　 2.YFN延緩大鼠卵巢衰老的藥效研究
　　 2.1動物模型的建立、分組及給藥方法
　　 選取24只16-18個(gè)月齡自然老化的SD雌鼠模型。按體重隨機(jī)分為老年對照組(O-C組)、陽性對照己烯雌酚片組(DT組，0.05mg/kg)、益婦寧高劑量組(YFN-H組，相當(dāng)于含生藥材2.0g/kg)、低劑量組(YFN-L組，相當(dāng)

7、于含生藥材1.0g/kg)，每組動物6只。另選3-4月齡SD大鼠6只作青年對照組（Y-C組）。連續(xù)灌胃給藥6周。
　　 2.2標(biāo)本的采集及研究方法(1)觀察大鼠進(jìn)食、飲水、毛色等一般情況及大鼠體重變化;采集標(biāo)本前兩周檢測各組大鼠陰道上皮角化情況，計(jì)算動情周期天數(shù);(2)末次給藥后動物禁食12h，各組大鼠腹主動脈采血，分離血清，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測外周血清性激素指標(biāo)雌二醇(E2)、睪酮(Te)、孕酮(P)含量;(3)剖取卵巢和子宮

8、進(jìn)行稱重，計(jì)算臟器指數(shù):臟器指數(shù)=組織濕重(mg)/體重(g)(×)100％;(3)各組大鼠卵巢、子宮、陰道組織用甲醛溶液固定，制作石蠟組織切片，通過HE染色觀察卵巢、子宮、陰道等生殖器官組織病理學(xué)變化。
　　 3.YFN延緩大鼠卵巢衰老的機(jī)制研究
　　 3.1抗氧化作用機(jī)制
　　 (1)采用紫外分光光度法檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MD

9、A)、過氧化氫(H2O2)的含量，并取肝組織冰浴勻漿，分別測定SOD、CAT活性和MDA、H2O2含量;(2)免疫組化檢測卵巢組織中氧化應(yīng)激蛋白p53及DNA損傷標(biāo)記物8-OHdG的表達(dá);(3)采用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)方法檢測卵巢組織中谷胱甘肽過氧化物酶1(Gpx1)、過氧化物酶3(Prdx3)、谷氨酰胺酶2(Gls2)、錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)等抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 3.2促細(xì)胞增殖作用機(jī)制

10、r>　　 采用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)及Western blotting方法檢測卵巢組織中細(xì)胞增殖負(fù)性調(diào)控因子p19、p53、p21、Rb基因和蛋白的表達(dá);
　　 結(jié)果：
　　 1.YFN有效成分檢測結(jié)果表明，益婦寧中蛋白質(zhì)含量為222.00±5.80mg/g，氨基酸含量為146.17±5.30 mg/g，雌二醇含量為0.0031±0.0001 mg/g，1-甲基海因?yàn)?.0528±0.0251mg/g，亞油酸

11、為391.7333±2.7392 mg/g，維生素E為0.1073±0.0096mg/g，莪術(shù)醇含量為1.1500±0.0014mg/g，哈蟆油中蛋白質(zhì)含量為442.70±7.87mg/g，氨基酸含量為287.07±5.99mg/g，雌二醇含量為0.0071±0.0001mg/g，1-甲基海因?yàn)?.1257±0.0060 mg/g，亞油酸為362.8100±4.3827mg/g,維生素E為.0.045±0.004mg/g，基本符合該復(fù)方

12、的組成:哈蟆油含量約為42％，莪術(shù)油含量為10％。
　　 2 YFN對衰老大鼠衰老體征、性激素指標(biāo)和生殖器官組織形態(tài)學(xué)的影響
　　 2.1一般指征:與Y-C組比較，O-C組大鼠神態(tài)萎靡，活動較少，毛發(fā)脫落較明顯，色澤暗發(fā)黃;DT組及YFN各組大鼠上述體征與O-C組比較均有所改善;且YFN-H、L組效果較DT組明顯。
　　 體重結(jié)果:Y-C組大鼠的體重隨著時(shí)間的增加而增重;O-C組大鼠體重變化不大，處于穩(wěn)定的趨勢，

13、與Y-C組比較具有顯著差異(P＜0.05);給藥各組體重與O-C組比較，差異無顯著性(P＞0.05）。
　　 動情周期結(jié)果: O-C組大鼠動情周期紊亂，動情周期較Y-C組顯著延長;DT組與YFN-H、L組能顯著縮短衰老大鼠的動情周期（P＜0.05），且YFN-H組的作用效果更顯著。
　　 卵巢指數(shù)結(jié)果:O-C組大鼠的卵巢指數(shù)與Y-C相比下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);DT組卵巢指數(shù)與O-C組相比上升，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

14、(P＞0.05)，而YFN-H組的能顯著升高衰老大鼠卵巢指數(shù)(P＜0.05)。
　　 子宮指數(shù)結(jié)果:O-C組大鼠的子宮指數(shù)與Y-C組相比顯著降低(P＜0.05)，DT組及YFN-H組能顯著升高衰老大鼠的子宮指數(shù)(P＜0.05)。
　　 2.2性激素指標(biāo)結(jié)果
　　 O-C組大鼠血清E2含量較Y-C組顯著降低(P＜0.05)，DT組及YFN-H、L組能顯著升高衰老大鼠血清E2含量(P＜0.05)。
　　 O-

15、C組大鼠血清Te含量較Y-C組顯著降低(P＜0.05)，DT組及YFN-H、L組能顯著升高衰老大鼠血清Te含量(P＜0.05)。
　　 O-C組血清P含量較Y-C組降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，DT組血清P含量較O-C組下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，DT組血清P含量與Y-C組比較顯著下降(P＜0.05)，YFN-H組血清P含量與O-C組比較升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，YFN-L組血清P含量與O-C組比較

16、下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但YFN-H、L組P含量與DT組相比仍顯著升高(P＜0.05)。
　　 2.3病理學(xué)結(jié)果
　　 2.3.1卵巢光鏡觀察:O-C組卵巢皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，以成熟卵泡為主，偶見少量初級、次級卵泡，各期卵泡數(shù)量較少，黃體發(fā)育正常，但與Y-C組相比黃體數(shù)目較少。
　　 DT組及YFN-H、L組卵巢皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)較O-C組清晰，初級及生長卵泡數(shù)量較多，可見成熟卵泡及排卵后形成的黃體，黃體數(shù)目增

17、多。
　　 2.3.2子宮光鏡觀察: O-C組子宮各層比例較Y-C組明顯改變，內(nèi)膜層呈現(xiàn)明顯萎縮變薄，細(xì)胞明顯變小，胞漿少，核固縮，內(nèi)膜層腺體分布明顯減少，腺體有分泌現(xiàn)象的變少，腺腔擴(kuò)大成囊，腺上皮扁平，胞漿少，毛細(xì)血管少，子宮漿膜層不明顯。
　　 DT組及YFN-H、L組與O-C組相比子宮各層結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜增厚，腺體數(shù)目增加，腺體分泌現(xiàn)象增多，子宮漿膜層可見，毛細(xì)血管豐富增多，且DT組較YFN-H、L子宮內(nèi)膜增厚明顯。

18、
　　 2.3.3陰道光鏡觀察:O-C組較Y-C組黏膜皺襞變少，復(fù)層扁平上皮明顯變薄，淺層空洞狀細(xì)胞變小，黏膜層變薄，固有層表層細(xì)胞漿呈嗜酸性，結(jié)締組織變疏松，陰道分泌物明顯減少。
　　 DT組及YFN-H、L組黏膜皺襞較O-C組增多，上皮細(xì)胞清晰，細(xì)胞數(shù)目增多，上皮淺層空洞狀細(xì)胞變大，固有層結(jié)締組織變致密，陰道腔分泌物的明顯增加。YFN-L組黏膜皺襞較YFN-H組更多，黏膜層更厚，上皮結(jié)構(gòu)更清晰，陰道腔分泌物更多，但Y

19、FN-H組固有層結(jié)締組織明顯較YFN-L組致密增厚，且YFN-H、L組比DT組黏膜層增厚明顯。
　　 3.YFN延緩大鼠卵巢衰老的機(jī)制研究結(jié)果
　　 3.1抗氧化作用結(jié)果
　　 3.1.1血清抗氧化指標(biāo)結(jié)果:
　　 O-C組血清SOD活性較Y-C組顯著下降(P＜0.05)，DT組及YFN-H、L組能顯著升高衰老大鼠血清SOD活性(P＜0.05)，且YFN-H、L組的作用明顯優(yōu)于DT組(P＜0.05)。

20、r>　　 O-C組血清GSH-Px活性較Y-C組顯著下降(P＜0.05)，DT組及YFN-H、L組血清GSH-Px活性與O-C組比較升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 O-C組血清CAT活性較Y-C組顯著下降(P＜0.05)，DT組血清CAT活性與O-C組比無顯著性差異(P＞0.05)，而YFN-H組能顯著升高衰老大鼠血清CAT活性(P＜0.05)。
　　 O-C組血清MDA含量較Y-C組顯著升高(P＜0.0

21、5)，DT組血清MDA含量與O-C組相比無顯著性差異(P＞0.05)，YFN-H、L組能顯著降低衰老大鼠血清MDA含量(P＜0.05)，且YFN-H組的作用尤為明顯。
　　 O-C組血清H2O2含量較Y-C組顯著升高(P＜0.05)，而DT組及YFN-H、L組能顯著降低血清H2O2含量(P＜0.05)，且YFN-H組的效果顯著優(yōu)于DT組(P＜0.05)。
　　 3.1.2肝組織抗氧化結(jié)果:
　　 O-C組肝組織S

22、OD活性較Y-C組顯著下降(P＜0.05)，DT組肝組織SOD活性與O-C組比較升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而YFN-H、L組能顯著升高衰老大鼠肝組織SOD活性(P＜0.05)，且YFN-L組作用尤明顯。
　　 O-C組肝組織CAT活性較Y-C組顯著下降(P＜0.05)，DT組及YFN-H、L組均能升高衰老大鼠肝組織CAT活性(P＜0.05)，YFN-H組效果顯著優(yōu)于YFN-L組，且均顯著優(yōu)于DT組(P＜0.05)。<

23、br>　　 O-C組肝組織MDA含量較Y-C組顯著升高(P＜0.05)，DT組肝組織MDA含量與O-C組比較無顯著性差異(P＞0.05)，而YFN-H、L組能顯著降低衰老大鼠肝組織MDA含量(P＜0.05)，且YFN-H組的效果優(yōu)于YFN-L組。
　　 O-C組肝組織H2O2含量較Y-C組顯著下降(P＜0.05)，DT組肝組織H2O2含量較O-C組顯著升高(P＜0.05)，而YFN-H、L組肝組織H2O2含量與O-C組相比無顯

24、著差異(P＞0.05)，但顯著低于DT組(P＜0.05)。
　　 3.1.3實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測結(jié)果
　　 O-C組卵巢組織GPX1、Prdx3、Mn-SOD基因的表達(dá)較Y-C組顯著下降(P＜0.05)，但GLS2基因的表達(dá)與Y-C組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），DT組及YFN-H、L組能顯著升高衰老大鼠卵巢組織GPX1、Prdx3、GLS2、Mn-SOD基因的表達(dá)(P＜0.05)，且YFN-H、L組

25、升高GPX1、Prdx3、GLS2基因的表達(dá)的作用優(yōu)于DT組(P＜0.05)。
　　 3.1.4免疫組化檢測結(jié)果
　　 免疫組化結(jié)果顯示大鼠卵巢組織中p53為胞核表達(dá)，陽性染色于各級卵泡的顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞、黃體細(xì)胞，黃體表達(dá)強(qiáng)于卵泡的表達(dá);DNA損傷標(biāo)志物8-OHdG為胞漿表達(dá)陽性染色主要于間質(zhì)細(xì)胞的胞漿。
　　 O-C組卵巢組織p53蛋白IOD值較Y-C組顯著升高(P＜0.05)，DT組及YFN-H、L組能顯

26、著降低衰老大鼠卵巢組織p53蛋白IOD值(P＜0.05)，YFN-H組作用尤明顯優(yōu)于YFN-L組，且均顯著優(yōu)于DT組(P＜0.05)。
　　 O-C組卵巢組織8-OHdG蛋白IOD值較Y-C組顯著升高(P＜0.05)，DT組及YFN-H、L組均能顯著降低衰老大鼠卵巢組織8-OHdG蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，YFN-L組作用尤明顯，且顯著優(yōu)于DT組（P＜0.05）。
　　 3.2促細(xì)胞增殖作用結(jié)果
　　 3.2.

27、1 qRT-PCR檢測結(jié)果
　　 O-C組卵巢組織p19、p53、p21、Rb基因的表達(dá)較Y-C組比較顯著升高(P＜0.05)，DT組及YFN-H、L組均能顯著降低衰老大鼠卵巢組織p19、p53、p21、Rb基因的表達(dá)(P＜0.05)，YFN-H組對p19、p53、p21基因表達(dá)降低的效果顯著優(yōu)于YFN-L組(P＜0.05）。與DT組比較，YFN-H組對p21基因表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，而DT組對p19基因表達(dá)降低的效果優(yōu)

28、于YFN-H組(P＜0.05)。
　　 3.2.2免疫印跡法檢測結(jié)果
　　 O-C組卵巢組織p19、p53、p21、Rb蛋白的表達(dá)較Y-C組比較均顯著升高(P＜0.05)，DT組及YFN-H、L組能顯著降低衰老大鼠卵巢組織p19、p53、p21、Rb蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，YFN-H組及DT組的效果顯著優(yōu)于YFN-L組(P＜0.05），且YFN-H組對p19、p53蛋白作用效果還顯著優(yōu)于DT組(P＜0.05)。

29、>　　 結(jié)論：
　　 1.YFN富含與提高機(jī)體免疫力和抗氧化有關(guān)的成分:蛋白質(zhì)，氨基酸，雌二醇，1-甲基海因，亞油酸，維生素E，莪術(shù)醇等，可能是其治療圍絕經(jīng)期綜合征及卵巢衰老的主要有效成分。
　　 2.YFN對改善衰老大鼠的一般體征，恢復(fù)動情周期，調(diào)節(jié)外周血性激素分泌，提高卵巢、子宮的臟器指數(shù)，延緩自然衰老引起的大鼠卵巢、子宮、陰道等生殖器官的萎縮退變等具有積極作用，
　　 3.YFN具有抗氧化作用和促細(xì)胞增殖