重復序列GAA及R5Y5的核小體定位理論與實驗研究.pdf

1、真核生物基因組以高度壓縮的染色體形式存在，核小體是構成染色質的基本結構單元，基因組上核小體的相對位置稱為核小體定位。核小體定位對包括DNA復制、修復、重組及可變剪接等在內的眾多生物學過程起著調控作用。比如，核小體的形成影響反式作用因子與核小體DNA的結合，為調控蛋白的結合提供了可選擇性;構成核小體的組蛋白尾部發(fā)生化學修飾可以改變染色質結構，從而影響其與調控因子的結合。所以，核小體作為一種真核生物染色體基本結構單元，履行著結構與功能的雙重

2、作用。核小體定位受到DNA序列內在特性及諸如組蛋白變體、組蛋白修飾、轉錄因子及RNA聚合酶競爭等外在因素的影響，其中DNA序列特性是影響核小體定位最為重要的因素之一。
　　基因組中特定位點三核苷酸重復序列（如GAA、CAG等）與40余種人類神經(jīng)系統(tǒng)的遺傳疾病相關，這類疾病的致病機理可能與重復序列局部染色質結構有關。研究發(fā)現(xiàn)Friedreich共濟失調(FRDA)患者體內FXN基因第一內含子中GAA重復序列周圍表觀遺傳修飾異常，而體

3、外實驗證實GAA22重復序列形成核小體能力較弱。在正常人體內，GAA重復序列的核小體定位特征及其對染色質局部結構的影響仍然是一個懸而未決的問題，該問題對于在染色質結構水平上理解FRDA疾病的致病機理具有重要的理論意義。
　　近30余年，人們利用各種方法尋找可能隱含在核小體DNA中的序列模體。以色列科學家Trofonov教授通過分析線蟲、果蠅、人和酵母等模式生物的核小體定位數(shù)據(jù)，分別建立了N-gram延伸模型、彎曲矩陣模型和堆積能模

4、型。三個模型從不同的角度對核小體占據(jù)的數(shù)據(jù)進行分析后提出了核小體定位的RRRRRYYYYY(R5Y5)序列模體，其中R是嘌呤，Y是嘧啶。R5Y5序列模體提出后，在國際上引起很大爭議，到目前為止，依然缺乏有效的實驗證明R5Y5序列模體對核小體定位的影響。
　　論文結合理論統(tǒng)計分析和體外實驗方法，研究了含GAA重復序列和R5Y5模體序列核小體定位的規(guī)律，期望理解DNA序列對核小體定位影響的機制。主要研究內容如下:
　　(1)首先

5、，統(tǒng)計了人基因組中18種三核苷酸重復序列核小體定位特征，結果發(fā)現(xiàn)富含AA或TT的三核苷酸重復序列形成核小體的能力非常弱。其次，重點關注與疾病相關的GAA重復序列的核小體定位特征，發(fā)現(xiàn)基因組中緊鄰GAA重復序列上游分布著大量的A-tracts，這些A-tracts的存在會影響局部染色質結構，GAA重復片段本身可以導致局部的核小體缺乏，而上游A-tracts會進一步加劇這種缺乏程度。體內含有GAA重復序列特定位點的核小體定位圖譜同樣證實GA

6、A重復序列是一個弱的核小體定位元件。
　　(2)從大腸桿菌中表達純化了6種重組組蛋白(H2A、H2B、H3、H4、H2A.Z和H3.3)，裝配了常規(guī)組蛋白八聚體、含變體H2A.Z及H3.3的組蛋白八聚體，這三種組蛋白八聚體可用于體外組裝核小體及染色質實驗。
　　(3)通過體外重組染色質實驗，發(fā)現(xiàn)了GAA重復序列可導致局部核小體占據(jù)率下降。構建了含有GAA7、GAA27、GAA42片段的3種重組質粒及含有CAG7、CAG27、

7、CAG44和601序列共4種實驗對照質粒。在質粒上組裝了染色質結構，通過微球菌核酸酶酶切實驗、電鏡和蔗糖梯度密度離心等方法發(fā)現(xiàn):相比于601序列，GAA42重復序列插入到質粒中不利于質粒形成染色質結構。進一步通過分析超速離心定量檢測發(fā)現(xiàn)，含有GAA重復序列的染色質結構比含有CAG重復序列或601序列的染色質結構松弛、核小體占據(jù)水平偏低，說明GAA重復序列插入到質粒中可能降低了重組質粒體外形成染色質結構的能力。
　　(4)通過體外重

8、組核小體的實驗，發(fā)現(xiàn)R5Y5是一種有利于常規(guī)核小體形成的序列模體?；赗5Y5模體及TA10.5-bp周期性規(guī)律，設計了CS1-CS6共6條序列，利用體外組裝核小體的實驗技術，研究了這些序列形成核小體的效率。結果發(fā)現(xiàn):在常規(guī)核小體形成過程中，DNA序列中R5Y5和TA10.5-bp周期特性都極其顯著地促進核小體的形成，相比較而言，TA10.5 bp周期性的影響更為顯著。在含有H2A.Z變體的核小體體外組裝過程中，TA10.5-bp周期性