一氧化氮合酶干預(yù)對(duì)大鼠梗死心肌內(nèi)移植細(xì)胞存活性及心功能的影響.pdf

1、目的：急性心肌梗死作為常見(jiàn)的心血管疾病，嚴(yán)重威脅著人類的生命。大量研究表明，骨髓干細(xì)胞移植治療心肌梗死，能明顯修復(fù)受損的心肌，誘導(dǎo)新生血管形成，改善心功能。但仍然存在移植細(xì)胞早期大量丟失，移植時(shí)機(jī)選擇等問(wèn)題，限制了其臨床應(yīng)用。心肌梗死發(fā)生后，心肌組織缺血缺氧，大量有害的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)被釋放，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）活性被激活，可能是導(dǎo)致移植細(xì)胞大量死亡的主要原因。為此，我們通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在心梗后不同時(shí)間點(diǎn)，將雄性SD大鼠骨髓間

2、充質(zhì)干細(xì)胞移植至雌性大鼠心肌梗死模型內(nèi)，觀察移植細(xì)胞在梗死區(qū)的存活情況和心功能變化，探討適合心梗后細(xì)胞移植治療的最佳時(shí)間選擇。并進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察心肌梗死后iNOS的表達(dá)變化規(guī)律，在此基礎(chǔ)上，觀察早期的iNOS 抑制劑干預(yù)對(duì)移植細(xì)胞存活率及心功能的影響，明確其對(duì)移植細(xì)胞存活及心肌修復(fù)的作用，為干細(xì)胞移植治療心肌梗死的臨床應(yīng)用提供必要的科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：1、急性心肌梗死（AMI）模型的制備：取體重150-180g、雌性SD大

3、鼠，采用永久性結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備AMI 模型，根據(jù)細(xì)胞移植時(shí)間不同隨機(jī)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的分離、培養(yǎng)：取體重100～130g、雄性SD大鼠，使用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)MSCs，并采用免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)培養(yǎng)的MSCs 進(jìn)行鑒定。3、細(xì)胞移植：根據(jù)細(xì)胞移植時(shí)間點(diǎn)的不同行原位二次開(kāi)胸，直視下將培養(yǎng)的MSCs （約1.2×106個(gè)）注射植入到梗死區(qū)中部心外膜下。4、移植細(xì)胞的定位檢測(cè)：使用Hoe

4、chst33342和BrdU對(duì)移植的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，免疫組織化學(xué)檢測(cè)與HE 染色相對(duì)應(yīng)，觀察移植細(xì)胞在心梗區(qū)的定位及分布。5、移植細(xì)胞的定量檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)雌性大鼠梗死區(qū)Y 染色體性別決定區(qū)sry基因序列的表達(dá)，作為檢測(cè)移植細(xì)胞存活率的定量比較指標(biāo)。6、心功能的檢測(cè)：細(xì)胞移植后4周，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠行心臟超聲檢查。7、心梗區(qū)iNOS表達(dá)規(guī)律的檢測(cè)：采用Western-blot 檢測(cè)心肌梗死后1h、3d、7d、10d、14d 梗死區(qū)

5、的iNOS表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：1、MSCs 鑒定：分離純化的第四代MSCs 經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)有CD29和CD44表達(dá)，無(wú)CD34表達(dá)，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)為CD44+/ CD34-，證明實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為MSCs。2、心肌梗死模型：冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎后，左室前壁變蒼白，心臟膨大，左心耳充血，心室收縮減弱，與未梗死區(qū)界線清楚，表明心肌梗死動(dòng)物模型制備成功。3、移植細(xì)胞存活情況和心功能觀察：實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組，心肌梗死（MI）組：心肌梗

6、死后不進(jìn)行MSCs 移植，于心梗后4周行心功能檢測(cè)作為對(duì)照；1h 移植組：于心肌梗死后1h 行MSCs 移植，移植后立即取材作為Y 染色體sry基因檢測(cè)的對(duì)照標(biāo)本；3d 移植組：于心肌梗死后3d 行MSCs 移植；7d 移植組：于心肌梗死后7d 行MSCs 移植。3d組和7d組均于移植后4周行心功能、移植細(xì)胞存活率及組織學(xué)檢測(cè)。Real-time PCR 檢測(cè)心肌梗死后7d 移植組MSCs 存活率明顯高于3d 移植組，MSCs存活率分別

7、為8.1％、2.5％（n=10，p<0.05）。心功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在MSCs 移植后4周，與MI組相比，3d 移植組左室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）和收縮末期內(nèi)徑（LVDs）無(wú)明顯縮小，左室短軸縮短率（FS）和左室射血分?jǐn)?shù)（EF）也無(wú)明顯提高，兩組無(wú)顯著性差異（n=10，p>0.05）。而7d 移植組在細(xì)胞移植后4周，LVDd和 LVDs 較3d 移植組和MI組均有明顯縮小，F(xiàn)S及EF 也明顯提高，與3d 移植組和MI組相比具有顯著性差異（n

8、=10，p<0.05）。組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，1h 移植組：Hoechst33342 標(biāo)記及BrdU陽(yáng)性的細(xì)胞主要分布于移植區(qū)域，細(xì)胞形態(tài)無(wú)變化；3d 移植組：細(xì)胞移植后四周，梗死區(qū)Hoechst33342 標(biāo)記及BrdU 陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量較少；7d 移植組：在梗死區(qū)有大量的帶有藍(lán)色熒光的移植細(xì)胞分布，部分細(xì)胞聚集形成血管樣結(jié)構(gòu)。BrdU免疫組化染色及相應(yīng)的HE 染色同樣發(fā)現(xiàn)在心肌梗死區(qū)有大量的移植細(xì)胞成團(tuán)聚集，部分血管內(nèi)皮可見(jiàn)BrdU 陽(yáng)性細(xì)

9、胞，提示移植的MSCs在宿主心肌組織的存活、增殖，并可能參與梗死區(qū)新生血管的形成，促進(jìn)心肌組織修復(fù)。4、心肌梗死后梗死區(qū)iNOS表達(dá)規(guī)律的觀察：梗死心肌內(nèi)iNOS的表達(dá)在心肌梗死后隨即增加，在心肌梗死后第3天達(dá)到高峰，隨后逐漸減少。在心梗后不同時(shí)間點(diǎn)梗死區(qū)iNOS表達(dá)強(qiáng)度的變化規(guī)律為:3d＞1h＞7d＞10d＞14d （n=5，p<0.05）。5、iNOS 抑制劑對(duì)移植細(xì)胞存活和心功能影響的觀察：治療組于細(xì)胞移植前12h 給予選擇性iN

10、OS 抑制劑1400W 2mg/kg，腹腔注射，2次/天，維持3天，四周后行心功能、移植細(xì)胞存活率及組織學(xué)檢測(cè)，對(duì)照組以等量生理鹽水代替。Real-time PCR 檢測(cè)顯示1400W 治療組和對(duì)照組Y 染色體sry基因序列的表達(dá)水平分別為4.2％、1.8％，結(jié)果表明，心肌梗死后第3天進(jìn)行細(xì)胞移植并給予早期的iNOS 抑制劑干預(yù)，移植細(xì)胞存活率可有明顯提高（n=10，P<0.01）。組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞分布散亂，數(shù)量

11、較少；治療組中BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且分布較集中。相對(duì)應(yīng)的HE 染色可見(jiàn)移植細(xì)胞的相似分布。然而，心功能檢查在治療組和對(duì)照組兩組間無(wú)顯著性差異（n=10，p>0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明iNOS 抑制劑的早期干預(yù)可以在一定程度上提高心梗后3d 移植組移植細(xì)胞的存活率，但對(duì)心功能卻無(wú)改善作用。
　　 結(jié)論：1、心肌梗死后第7天進(jìn)行MSCs 移植，在移植細(xì)胞存活率和心功能的改善上均優(yōu)于心肌梗死后第3天進(jìn)行細(xì)胞移植。2、iNOS