負(fù)載轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的殼聚糖緩釋微球復(fù)合納米骨修復(fù)兔橈骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：
　　在實(shí)驗(yàn)室中自行制備轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）/殼聚糖緩釋微球、納米羥基磷灰石/膠原支架材料及負(fù)載轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）/殼聚糖緩釋微球的納米羥基磷灰石/膠原支架材料。然后分別以單純支架材料及負(fù)載轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）/殼聚糖緩釋微球的支架材料應(yīng)用于兔橈骨骨缺損的修復(fù)。通過(guò)觀察術(shù)后各個(gè)固定時(shí)間段骨缺損區(qū)成骨修復(fù)情況，來(lái)證實(shí)納米羥基磷灰石/膠原骨修復(fù)兔橈骨骨缺損的能力及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

2、在骨組織修復(fù)過(guò)程中的效應(yīng)。為應(yīng)用骨組織工程方式臨床修復(fù)大塊骨缺損探尋一種有效的方法。
　　研究方法：
　　1.應(yīng)用乳化交聯(lián)法制備負(fù)載TGF-β1的殼聚糖緩釋微球，并對(duì)TGF-β1殼聚糖緩釋微球的外觀形態(tài)、載藥量、包封效率及體外釋放情況進(jìn)行分析。
　　2.制備納米羥基磷灰石/膠原骨及納米人工骨/TGF-β1殼聚糖緩釋微球復(fù)合人工骨，并對(duì)兩種人工骨進(jìn)行掃描電鏡觀察、孔隙率、力學(xué)性能進(jìn)行測(cè)定。
　　3.選擇普通新西蘭大

3、白兔45只，雙側(cè)橈骨手術(shù)建立10mm骨缺損模型，同時(shí)將單純納米羥基磷灰石/膠原骨支架材料植入左側(cè)橈骨骨缺損中，設(shè)定為對(duì)照組；將負(fù)載轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）/殼聚糖緩釋微球的納米羥基磷灰石/膠原支架材料植入右側(cè)橈骨骨缺損中，設(shè)定為實(shí)驗(yàn)組。在手術(shù)后的第2周、第4周、第6周、第8周、第12周時(shí)間段，每次隨機(jī)從45只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中選取9只處死，對(duì)其雙前肢行X射線拍照、缺損手術(shù)區(qū)行骨密度測(cè)定及病理切片組織學(xué)分析，對(duì)各個(gè)不同時(shí)期骨缺損修復(fù)情況

4、進(jìn)行評(píng)估。對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的不同評(píng)估數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、對(duì)比，從而證實(shí)兩種不同支架材料修復(fù)骨缺損的效果是否存在差異。
　　結(jié)果：
　　制備的 TGF-β1/殼聚糖緩釋微球的性狀：微球呈淡黃色粉末狀。掃描電鏡觀察到所制備的 TGF-β1殼聚糖微球基本呈類球形，大小均勻，直徑約為5μm，表面光滑，有較多微小孔隙，分散度較好。TGF-β1/殼聚糖緩釋微球的載藥量和包封率測(cè)定結(jié)果：共放入TGF-β1的量為5μg，TGF-β1殼聚糖微

5、球10mg溶解后制備得到的上清液樣本以人TGF-β1 ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，TGF-β1殼聚糖微球的載藥量為22.9μg/g，包封率為79.5%。TGF-β1殼聚糖微球體外釋放情況：在前12小時(shí)內(nèi)TGF-β1因子釋放速度較快，以后逐漸平緩，到第6天，TGF-β1殼聚糖微球釋放量為55.5%。
　　大體觀察：在手術(shù)后2周時(shí)，在實(shí)驗(yàn)側(cè)手術(shù)部位支架材料的輪廓是清晰的，觸之感覺(jué)其硬度增加，其與兔橈骨的兩端連接部位連接牢固。而對(duì)照組支架

6、材料輪廓也清晰，局部觸之無(wú)明顯變硬，連接部位連接無(wú)實(shí)驗(yàn)側(cè)牢固，但未出現(xiàn)移位情況；手術(shù)后第4周，切口處支架材料的輪廓已不明顯，實(shí)驗(yàn)側(cè)手術(shù)部位已看不到輪廓。人工骨與宿主骨斷端間結(jié)合更加緊密，移植材料體表觸感質(zhì)地更加堅(jiān)硬。對(duì)照側(cè)納米骨與宿主骨間連接緊密程度及堅(jiān)硬程度較實(shí)驗(yàn)組差；術(shù)后第6周，實(shí)驗(yàn)側(cè)人工骨與宿主骨斷端間可捫及隆起骨痂，質(zhì)地變硬。對(duì)照側(cè)支架材料與橈骨交界處也可以觸及新形成的骨痂，但是其大小及硬度均不如實(shí)驗(yàn)側(cè)；手術(shù)后第8周，實(shí)驗(yàn)側(cè)支架

7、材料外部也變硬，形成包殼樣結(jié)構(gòu)，支架材料與橈骨交界處形成的骨痂觸之更加堅(jiān)硬，連接部位結(jié)合已十分牢固，對(duì)照側(cè)也可捫及硬的包殼及骨痂，但其硬度不如實(shí)驗(yàn)側(cè)，其連接部位結(jié)合也比較牢固；手術(shù)后第12周，實(shí)驗(yàn)側(cè)的支架材料處外部觸之已十分堅(jiān)硬，交界處的骨痂已基本觸不到，手術(shù)區(qū)骨質(zhì)與宿主骨觸之已十分相似，對(duì)照側(cè)較實(shí)驗(yàn)側(cè)為差。
　　X射線觀察：觀察內(nèi)容包括骨形成、骨連接及骨塑形3個(gè)方面11項(xiàng)內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)側(cè)在術(shù)后2周即有成骨表現(xiàn)，但成骨部分占骨缺損部分

8、比例不到25%，交界處可見(jiàn)少許骨痂形成，分界線模糊，未見(jiàn)骨塑形情況；對(duì)照側(cè)未見(jiàn)明顯成骨表現(xiàn)，交界處分界線清晰，無(wú)骨塑形情況。4周時(shí)實(shí)驗(yàn)側(cè)有部分骨痂形成，成骨部分占骨缺損部分比例達(dá)到25%，但不足50%，交界處可見(jiàn)部分骨痂形成，分界線更為模糊，但未消失，未見(jiàn)明顯骨塑形情況；對(duì)照側(cè)可見(jiàn)成骨表現(xiàn)，但成骨部分占骨缺損部分比例不到25%，交界處分界線模糊，無(wú)骨塑形情況。6周時(shí)實(shí)驗(yàn)側(cè)有大量骨痂形成，成骨部分占骨缺損部分比例達(dá)50%，但未超過(guò)75%，

9、植入骨與宿主骨接觸間隙極為模糊至基本消失，未見(jiàn)正常髓腔形成及皮質(zhì)骨塑形；對(duì)照側(cè)成骨部分占骨缺損部分比例達(dá)到25%，但不足50%，交界處可見(jiàn)有少許骨痂形成，分界線已經(jīng)模糊，未見(jiàn)正常髓腔形成及皮質(zhì)骨塑形。8周時(shí)實(shí)驗(yàn)側(cè)骨痂進(jìn)一步增加，成骨占骨缺損部分比例達(dá)75%以上，但骨缺損未完全愈合，植入骨與宿主骨接觸間隙基本消失，可見(jiàn)到髓腔樣結(jié)構(gòu)形成但無(wú)皮質(zhì)骨塑形表現(xiàn)；對(duì)照側(cè)也有大量骨痂形成，成骨部分占骨缺損部分比例達(dá)50%，但未超過(guò)75%，植入骨與宿主

10、骨接觸間隙極為模糊，未見(jiàn)正常髓腔形成及皮質(zhì)骨塑形。12周時(shí)實(shí)驗(yàn)側(cè)骨缺損全部愈合，新生骨完全填充骨缺損部位，移植骨-宿主骨間隙完全消失，髓腔再通，皮質(zhì)骨已經(jīng)塑形成為成熟的板層骨；對(duì)照側(cè)骨痂進(jìn)一步增加，新生骨占骨缺損部分比例達(dá)75%以上，但骨缺損未完全愈合，植入骨與宿主骨接觸間隙基本消失，可見(jiàn)到髓腔樣結(jié)構(gòu)形成但無(wú)皮質(zhì)骨塑形表現(xiàn)。
　　骨密度測(cè)定：骨密度，全稱“骨骼礦物質(zhì)密度”。骨密度是骨質(zhì)量的一個(gè)重要標(biāo)志。手術(shù)后第2周對(duì)實(shí)驗(yàn)側(cè)骨缺損區(qū)

11、行骨密度測(cè)定，發(fā)現(xiàn)骨缺損區(qū)支架材料骨密度值比體外制備的納米支架材料骨密度值增高；并在隨后的第4周、第6周、第8周及第12周行骨密度測(cè)定，其數(shù)值均高于體外納米支架材料的骨密度數(shù)值，并且其骨密度值隨時(shí)間的增長(zhǎng)而增高，尤其在術(shù)后第12周，骨缺損區(qū)的骨密度測(cè)定數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物橈骨本身骨密度數(shù)值達(dá)到同一水平。而在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的對(duì)照側(cè)，骨缺損區(qū)的骨密度數(shù)值高于體外納米支架材料密度出現(xiàn)在術(shù)后第4周。在隨后的幾個(gè)時(shí)間段其骨缺損區(qū)骨密度數(shù)值也隨時(shí)間而增高，但是

12、即便在第12周時(shí)，缺損區(qū)骨密度數(shù)值也低于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物橈骨本身的骨密度數(shù)值。
　　組織學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)側(cè)在術(shù)后2周即表現(xiàn)活躍成骨，成骨類細(xì)胞增加，局部開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，對(duì)照組的成骨活躍程度較實(shí)驗(yàn)組要差；復(fù)合支架材料的實(shí)驗(yàn)組在手術(shù)后第2周病理切片局部可以觀察到在材料周邊有骨痂形成，隨時(shí)間推移，在以后的第4周、第6周、第8周時(shí)間段，骨痂的數(shù)量逐漸增多，組織學(xué)結(jié)構(gòu)“骨單位”開(kāi)始形成并出現(xiàn)，骨單位逐漸增多并成熟。納米支架材料在體內(nèi)逐漸被降解、

13、吸收，破骨細(xì)胞對(duì)新生骨進(jìn)行改建，髓腔結(jié)構(gòu)逐漸形成，在手術(shù)后的第12周，骨單位均已十分成熟，大量板層骨在骨缺損區(qū)形成，板層骨已經(jīng)取代了排列雜亂的新生骨，髓腔再通，局部骨缺損得以修復(fù)，新骨與宿主骨已完全結(jié)合，塑形完成。單純支架材料的對(duì)照側(cè)在材料周邊病理切片觀察到新生骨出現(xiàn)在手術(shù)后第4周，其進(jìn)程與實(shí)驗(yàn)側(cè)成骨進(jìn)程相似，但在同一時(shí)間段，對(duì)照側(cè)的成骨數(shù)量及新生骨的成熟度均較實(shí)驗(yàn)側(cè)差，在術(shù)后第12周時(shí)，雖然出現(xiàn)的骨單位結(jié)構(gòu)也逐漸成熟，并且逐漸增多的大

14、量骨痂填充骨缺損區(qū)，但新骨的改建及塑形還沒(méi)有完成，髓腔結(jié)構(gòu)剛剛開(kāi)始形成，沒(méi)有形成大量成熟的板層骨。
　　結(jié)論：
　　1.采用乳化交聯(lián)方法制備復(fù)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的殼聚糖緩釋微球的方法簡(jiǎn)便易行，成球性好，獲取率高，具有優(yōu)良的緩釋效果。
　　2. TGF-β1對(duì)創(chuàng)傷、腫瘤、先天畸形等原因?qū)е碌墓侨睋p的修復(fù)、骨組織的生長(zhǎng)等方面發(fā)揮著積極的效應(yīng)。其發(fā)揮效應(yīng)的機(jī)制是TGF-β1對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化、微血管形成及細(xì)胞外基質(zhì)的形成