玉米熱激轉(zhuǎn)錄因子ZmHsfA4a的抗旱功能研究.pdf

1、玉米是我國三大禾本科糧食作物之一，既可作為糧食，也可作為重要的工業(yè)原料，在保證糧食生產(chǎn)及糧食安全方面發(fā)揮重要作用。但是玉米在生長過程中，經(jīng)常遭受一些不良環(huán)境因子的影響，從而導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，其中最主要的是非生物逆境因子，如高溫、干旱及高鹽等。目前，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行作物遺傳改良、培育抗逆新品種以提高作物抗逆性，是保證糧食產(chǎn)量和品質(zhì)的最為行之有效的方法之一。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在植物的抗逆應(yīng)答過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，它們可以同時激活或

2、抑制多個下游基因的表達(dá)，效果更加顯著，目前在植物中很多轉(zhuǎn)錄因子基因被鑒定參與逆境應(yīng)答反應(yīng)。HSF是植物中重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛參與到植物的生長發(fā)育及非生物逆境響應(yīng)過程，在模式植物擬南芥及番茄中，HSF基因的作用機(jī)制已被研究清楚。然而，玉米作為重要糧食作物，其HSF基因的功能研究還未見報道，分子作用機(jī)制也不清楚。根據(jù)實驗室相關(guān)研究基礎(chǔ)，獲得了一個潛在與逆境相關(guān)的HSF基因ZmHsfA4a，通過基因表達(dá)、基因特征以及過表達(dá)分析對其抗旱

3、功能進(jìn)行鑒定，并通過互作蛋白鑒定進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制。獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.從玉米B73中克隆得到ZmHsfA4a全長CDS序列，測序結(jié)果與B73基因組數(shù)據(jù)庫公布序列完全一致，該基因全長1302bp，編碼433個氨基酸?；蛐酒瑪?shù)據(jù)顯不ZmHsfA4a在玉米的各個組織中均有表達(dá)，其中在葉中表達(dá)水平較高，熒光定量PCR結(jié)果顯示ZmHsfA4a在檢測的六個組織，根、莖、葉、雄穗、花絲、及包被葉中均表達(dá)、且在葉中表達(dá)水平較高，這

4、與芯片數(shù)據(jù)基本一致。誘導(dǎo)表達(dá)分析結(jié)果顯示，ZmHsfA4a受到干旱和高溫誘導(dǎo)表達(dá)，而在ABA和NaCl處理下呈下調(diào)表達(dá)。
　　2.亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示ZmHsfA4a-p1305融合蛋白只在細(xì)胞核中表達(dá)，表明ZmHsfA4a是一個核定位蛋白;轉(zhuǎn)錄活性分析結(jié)果表明，ZmHsfA4a在酵母AH109菌株中具有轉(zhuǎn)錄活性，并且主要活性區(qū)域位于230-280氨基酸之間。
　　3.構(gòu)建過表達(dá)載體ZmHsfA4a-p1301a，通過農(nóng)桿菌介

5、導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥。轉(zhuǎn)基因擬南芥在含有300mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)率顯著高于野生型，且在干旱條件下，轉(zhuǎn)基因植株的耐受性增強(qiáng)。表達(dá)分析顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥中逆境相關(guān)基因在干旱處理之后的表達(dá)水平升高，并且高于野生型植株。
　　4.ZmHsfA4a過表達(dá)到水稻zhonghua11中，轉(zhuǎn)基因水稻對干旱抗性增強(qiáng)。干旱處理后，轉(zhuǎn)基因水稻植株的相對電導(dǎo)率及丙二醛含量顯著低于野生型植株，并且干旱處理后一些逆境相關(guān)基因的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)基因植株中要高于野

6、生型植株，這些結(jié)果進(jìn)一步表明ZmHsfA4a增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻抗旱性。此外轉(zhuǎn)基因水稻對外源ABA的敏感性增加，說明ZmHsfA4a參與水稻ABA介導(dǎo)信號通路。
　　5.過表達(dá)ZmHsfA4a增加了轉(zhuǎn)基因玉米對干旱耐受性。相對失水率實驗表明轉(zhuǎn)基因植株相對于野生型植株的相對失水率較低，干旱處理后，轉(zhuǎn)基因玉米的相對電導(dǎo)率及丙二醛含量顯著低于野生型植株，但游離脯氨酸含量顯著高于野生型植株，這表明轉(zhuǎn)基因玉米抗旱性增強(qiáng)。對ABA含量測定發(fā)現(xiàn)，正

7、常情況下轉(zhuǎn)基因玉米與野生型植株沒有差異，干旱處理后轉(zhuǎn)基因玉米ABA含量顯著高于野生型植株，并且ABA合成相關(guān)基因ZmVP14的表達(dá)與ABA含量趨勢相一致，說明ZmHsfA4a參與了玉米ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。BIFC和pulldown實驗結(jié)果表明，ZmHsfA4a可以自身相互作用形成同源多聚體，并且ZmHsfA4a可以與EMP2相互作用。
　　以上實驗結(jié)果表明，ZmHsfA4通過ABA介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與干旱脅迫應(yīng)答調(diào)控，同時EMP2