玉米bHLH類轉錄因子基因B695的功能分析.pdf

1、bHLH類轉錄因子作為一類含有螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix，HLH)結構域且富含堿性氨基酸的調控蛋白質，在植物生長、發(fā)育及對干旱、高鹽、重金屬等脅迫中起重要作用。而金屬錳作為植物體生長必需的微量營養(yǎng)元素，參與植物體的各種代謝反應；但是錳毒是酸性土壤中限制作物產量的重要因子，Mn的大量積累會對植物體造成嚴重的毒害。了解植物體bHLH類轉錄因子的表達調控機制對改良作物抗逆性有重要意義。
　　 本論文對玉米中一個編

2、碼bHLH類轉錄因子基因B695進行了較為深入的功能分析，主要研究結果如下：
　　 1.從玉米中克隆了一個編碼bHLH類轉錄因子基因B695。該基因全長cDNA序列749 bp，其中開放閱讀框為749 bp，HLH保守域位于第92-143個氨基酸之間。
　　 2.構建pEGAD-B695植物GFP穩(wěn)定表達載體，轉化洋蔥表皮細胞，在熒光顯微鏡下觀察。結果顯示B695具核定位信號，定位于洋蔥的細胞核中。
　　 3.構

3、建pET-30a-B695原核表達載體，通過IPTG誘導表達出在C端帶有6×His標簽的融合蛋白，B695融合蛋白大小約為32kDa；同時制備了B695多克隆抗體，經(jīng)Western Blot檢測表明多克隆抗體與目的蛋白識別良好。
　　 4.利用酵母單雜交的方法驗證了B695在酵母中能夠激活報告基因的表達，具有轉錄激活功能，而且具有該功能的結構域位于C端，其N端則不具備轉錄激活功能。
　　 5.通過Real-time PC

4、R的方法，分析不同重金屬脅迫處理下B695在玉米中的內源表達情況。結果顯示：Fe、Mn、Cu、Zn都可誘導B695的表達；Mn可以激發(fā)玉米中內源B695基因的表達。
　　 6.通過對酵母轉基因菌株的脅迫處理發(fā)現(xiàn)，轉B695基因的酵母能夠顯著提高AH109酵母菌株對逆境脅迫(高鹽，干旱，重金屬)的適應能力，尤其是對金屬Mn，當Mn2+外界濃度高達正常濃度的200倍時，轉B695基因的酵母仍能正常生長；同時通過各種脅迫處理的1/2

5、MS平板上對B695過表達轉基因系和野生型煙草植株種子萌發(fā)率、表型觀察和形態(tài)指標統(tǒng)計，證明B695提高了轉基因植物對Mn的耐受性。
　　 7.對Mn脅迫處理后的B695轉基因煙草過表達系＃6、＃7、＃8，和野生型對照組煙草植株進行NBT和DAB染色，發(fā)現(xiàn)轉B695基因過表達系植株體內的活性氧(超氧陰離子，過氧化氫)水平明顯低于野生型，B695過表達系煙草的生長狀況也要優(yōu)于野生型對照組；活性氧清除相關酶的酶活測定及Real-tim

6、e PCR結果顯示B695過表達系煙草在錳處理后，體內的活性氧清除相關酶活性及其編碼基因表達水平明顯高于野生型對照組，說明B695能減少植物體內ROS的積累。
　　 8.通過Real-time PCR分析，在正常條件和Mn處理條件下，抗逆相關基因NtCDPK2、NtAREB、NtERF在B695轉基因煙草中的表達量均低于野生型，NtLEA5表達量相差不大，跨膜運輸相關基因Nramp、Irt1表達量低于野生型。證明由于B695的作

7、剛，使得過量表達轉基因煙草在Mn脅迫處理后在調控水平上引起了某些相關基因的表達量的改變，從而導致在表型上表現(xiàn)出對錳脅迫抵抗能力提升的現(xiàn)象
　　 9.通過測定Mn處理后B695轉基因煙草與野生型煙草體內的鐵與錳含量，發(fā)現(xiàn)B695轉基因煙草體內的含鐵量高于野生型對照組，錳含量遠遠低于野生型對照組，驗證了IRT1和Nramp可以在缺鐵環(huán)境下能夠提高植物中吸收錳的能力；并且由于B695的作用，可以減少植株對Mn的過量吸收，使植物體內Mn

8、含量保持在一個不影響植物正常生命活動的濃度。
　　 10.短時間的Mn脅迫處理野生型對照組與B695轉基因煙草后的活性氧染色結果說明，該轉錄基因屬于誘導性轉錄因子，當外界提供Mn信號時，B695開始發(fā)揮作用，在短時期內使植物體內的活性氧積累恢復到正常水平。
　　 由上述結果初步推測，B695可能作為一類調控蛋白，參與Mn相關的逆境信號通路，與植物體內Mn的穩(wěn)態(tài)調節(jié)相關，并對ROS水平起重要調節(jié)作用。本研究試圖弄清非生物逆