玉米HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族抗旱相關(guān)基因的鑒定及ZnYihdzlo功能分析.pdf

1、玉米是世界上重要的糧食作物之一,干旱、鹽漬、低溫等非生物脅迫對(duì)玉米的生長造成了嚴(yán)重的影響,也是限制其產(chǎn)量的主要脅迫因素,抗逆育種一直是重要的育種目標(biāo)。挖掘抗逆相關(guān)功能基因并利用這些基因培育抗逆新品種是應(yīng)對(duì)逆境脅迫,提高玉米產(chǎn)量的最為有效途徑。研究表明,轉(zhuǎn)錄因子在提高作物對(duì)脅迫的耐受性過程中起到了重要作用。過量表達(dá)特定的脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個(gè)下游抗逆功能基因的同時(shí)表達(dá),從而使作物獲得良好的綜合改良效果。目前,這種方法已經(jīng)成為植物抗逆

2、遺傳改良育種中的研究熱點(diǎn)。同源異型-亮氨酸拉鏈(HD-Zip)蛋白是高等植物特異的一類轉(zhuǎn)錄因子,參與了植物的脅迫應(yīng)答和生長發(fā)育調(diào)控。因此,挖掘脅迫應(yīng)答HD-Zip基因?qū)﹂_展玉米抗逆改良育種具有重要的意義。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)玉米全基因組HD-Zip基因進(jìn)行鑒定,分析這些基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、進(jìn)化關(guān)系以及干旱誘導(dǎo)表達(dá)模式,并通過過量表達(dá)技術(shù)對(duì)玉米Zmhdz10基因在植物非生物脅迫應(yīng)答過程中的功能及作用機(jī)制進(jìn)行了研究,獲得了如下主要結(jié)果:

3、
　　1.通過Blast同源搜索,共鑒定了55個(gè)非重復(fù)的玉米HD-Zip基因家族成員并從基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化等方面進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn),玉米HD-Zip家族的大部分基因序列高度保守,與擬南芥和水稻HD-Zip基因在結(jié)構(gòu)上不存在明顯差異。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系,55個(gè)玉米HD-Zip基因被進(jìn)一步分為4個(gè)亞族(I-IV)。染色體定位分析顯示,55個(gè)基因在10條染色體上的分布是非隨機(jī)的。對(duì)玉米HD-Zip基因復(fù)制事件進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)參與片段復(fù)制的基因占玉

4、米HD-Zip基因總數(shù)的62％,表明片段復(fù)制對(duì)玉米HD-Zip基因數(shù)量的擴(kuò)張起到了重要作用。
　　2.對(duì)17個(gè)HD-ZipI基因上游2kb啟動(dòng)子序列的抗逆相關(guān)順式作用元件(ABRE,LTRE和DRE)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)除Zmhdz16外,其余16個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域均含有1到多個(gè)抗逆相關(guān)順式作用元件。對(duì)復(fù)制基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的3種順式作用元件的分布進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)三種順式作用元件在復(fù)制基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的數(shù)量和位置有較大的差異。利用熒光定量

5、PCR方法對(duì)HD-ZipI基因的干旱誘導(dǎo)表達(dá)模式進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)有12個(gè)基因的表達(dá)顯著上調(diào),其它5個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。對(duì)復(fù)制基因的干旱誘導(dǎo)表達(dá)模式進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)復(fù)制基因的表達(dá)模式總體較為相似,說明這些基因可能存在著基因功能的冗余現(xiàn)象。
　　3.根據(jù)進(jìn)化關(guān)系和干旱誘導(dǎo)表達(dá)模式,篩選了一個(gè)受干旱強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)的候選基因Zmhdz10并從玉米自交系B73中克隆了該基因。序列分析顯示,Zmhdz10基因cDNA全長為825bp,編碼274個(gè)氨基

6、酸,與玉米B73數(shù)據(jù)庫中公布的序列完全一致。進(jìn)一步的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)Zmhdz10的表達(dá)還受到鹽和外源ABA的誘導(dǎo)。組織表達(dá)模式分析顯示,Zmhdz10在根、莖、葉、果穗、雄花序、幼芽和花絲7個(gè)組織中均有表達(dá),其中在葉中的表達(dá)量最高。通過基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)分析顯示,Zmhdz10-GFP融合表達(dá)蛋白定位在細(xì)胞核中。酵母雜交實(shí)驗(yàn)表明,Zmhdz10在酵母細(xì)胞中能夠激活報(bào)告基因的表達(dá),能夠?qū)Ψ聪蛑貜?fù)序列CAAT(A/T)ATTG發(fā)

7、生特異性的結(jié)合。
　　4.過量表達(dá)Zmhdz10的轉(zhuǎn)基因植株在生長表型上與對(duì)照植株沒有明顯差異。在干旱和鹽脅迫處理后,Zmhdz10轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出對(duì)脅迫較強(qiáng)的耐受性。通過對(duì)相對(duì)電解質(zhì)滲透率、丙二醛含量和脯氨酸含量等生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在脅迫條件下的相對(duì)電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量低于野生型植株,脯氨酸含量高于野生型植株。另外,ABA敏感性實(shí)驗(yàn)顯示Zmhdz10過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株顯著提高了對(duì)外源ABA的敏感性。

8、　　5.Zmhdz10過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株同樣表現(xiàn)出對(duì)干旱和鹽脅迫較強(qiáng)的適應(yīng)性和忍耐力。通過對(duì)P5CS1、RD22、RD29B和ABI14個(gè)脅迫/ABA應(yīng)答功能基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),在干旱條件下,這些抗逆功能基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量顯著高于野生型植株,表達(dá)被激活。對(duì)參與非依賴ABA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的ERD1表達(dá)分析顯示,該基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)沒有顯著差異。
　　綜上所述,本研究通過Blast同源搜索,在玉米全基因組